"Dan Ferro has taught some of the most
important singers of the 20th Century"
Brian Zeger - The Juilliard School
The Metropolitan Opera

"Intensive study of vocal technique as applied to the literature for active singers"

Tuberculose dans le diabète de type mal contrôlé: altération de l’expression des cytokines dans les globules blancs périphériques

Contexte Bien que la base biologique pour la susceptibilité accrue des patients diabétiques à la tuberculose reste incertaine, le monde subit une pandémie de type diabète Nous supposons que l’hyperglycémie chronique conduit à l’immunocompromis qui facilite la progression vers la tuberculose active Pour évaluer cette possibilité, nous avons déterminé si les patients Les échantillons de sang total provenant de patients atteints de tuberculose et de diabète et de patients atteints de tuberculose qui n’avaient pas de diabète ont été stimulés chez des patients atteints de tuberculose non diabétique. Nous avons ensuite déterminé s’il existait une association entre les niveaux de cytokines innées et adaptatives sécrétées en réponse à l’antigène et au diabète, ou le diabète avec mesure de l’hyperglycémie chronique. Les réponses innées et de type cytokine étaient significativement plus élevées chez les patients atteints de tuberculose qui avaient le diabète que chez les sujets témoins non diabétiques. L’effet était significativement et significativement plus marqué chez les patients diabétiques souffrant d’hyperglycémie chroniqueConclusions Ces données fournissent des preuves préliminaires Ce type de diabète, en particulier le diabète de type hyperglycémie chronique, est associé à une réponse immunitaire altérée à la tuberculose M. Une connaissance plus détaillée des mécanismes sous-jacents devrait se concentrer sur l’effet de l’hyperglycémie chronique sur la réponse immunitaire pour aider à comprendre la susceptibilité accrue du diabétique. les patients à la tuberculose

Une des conséquences de la pandémie de diabète de type est une augmentation de la fréquence et de la sévérité de l’infection chez les patients diabétiques, y compris une augmentation du risque de développer une tuberculose pulmonaire La base moléculaire de cette prédisposition à la tuberculose est Une étude de l’immunité contre les autres antigènes microbiens chez les patients diabétiques suggère que les réponses adaptatives et innées sont compromises, en particulier chez les patients atteints de tuberculose latente. hyperglycémie mesurée par taux élevé d’hémoglobine glycosylée [HbAc] Les troubles immunitaires semblent être réversibles avec un meilleur contrôle glycémique [,,] Bien que la sensibilité à la tuberculose chez les diabétiques soit reconnue depuis plus d’un siècle, par l’épidémie de diabète de type actuel, sommes-nous commencer Les cytokines du système immunitaire inné et adaptatif orchestrent la réponse à Mycobacterium tuberculosis, avec l’induction subséquente de l’immunité de type cellulaire, ce qui est essentiel pour la protection Un modèle de souris récemment développé pour Le diabète et la tuberculose ont révélé une charge bactérienne plus élevée et une altération de l’expression de l’IFN-γ chez les souris atteintes de diabète chronique, mais non aigu . L’hyperglycémie persistante joue apparemment un rôle important dans la pathologie.Dans ce contexte, nous évaluons les différences de sécrétion de cytokines antigène de la tuberculose chez les patients diabétiques et non diabétiques atteints de tuberculose, sélectionnés parmi une population de patients connus pour avoir des taux élevés de diabète de type Pour cela, nous avons adapté une procédure de stimulation ex vivo relativement simple. réponses aux antigènes M tuberculosis Nous avons émis l’hypothèse que, en cas de déficience de la réponse immunitaire joue un rôle dans la susceptibilité à la tuberculose chez les patients atteints de diabète, nous devrions être en mesure de détecter des différences dans les réponses cytokines aux antigènes M tuberculosis chez ces patients, en particulier chez ceux qui ont un faible contrôle glycémique

Patients, matériaux et méthodes

Nous avons identifié des patients suspects de tuberculose pulmonaire, ⩾ ans qui se sont présentés séquentiellement dans des cliniques de référence pour la tuberculose dans le sud du Texas Hidalgo et dans le département de santé du comté de Cameron et au nord-est du Mexique. Patients sans confirmation microbiologique de l’infection à M tuberculosis sans résultats positifs de frottis et / ou de culture ont été exclus de l’analyse, tout comme les patients avec infection confirmée par ELISA ou auto-déclarée, en raison de l’association forte et bien caractérisée de l’infection VIH avec immunodéficience et tuberculose Nous avons également exclu les patients qui avait reçu un traitement pour & gt; Nous avons inclus les patients qui avaient reçu un traitement antimycobactérien pendant ⩽ jours, après avoir établi qu’ils ne différaient pas des patients non traités dans leur réponse à la PPD voir Résultats Les participants ont été recrutés conformément avec des lignes directrices des commissions d’examen institutionnel des institutions participantes des deux pays. Entretiens avec les patients et prélèvement d’échantillons. Entretiens avec les patients. Caractéristiques sociodémographiques, résultats cliniques et diabète autodéclaré. La taille et le poids ont été enregistrés pour estimer l’indice de masse corporelle divisé par Les échantillons de sang total dans l’EDTA ont été conservés à – ° C pour mesurer le niveau d’HbAc. Un tube héparinique a été utilisé pour les dosages de cytokines du sang total décrits ci-dessous et des échantillons de plasma ont été utilisés pour déterminer les niveaux d’insuline. a été évalué par mesurer le niveau d’HbAc en utilisant un kit commercial normalisé pour des échantillons de sang qui ont été préalablement congelés Colonne d’affinité Glyco-Tek; Helena Laboratories Ce kit définit un taux élevé d’hémoglobine anormal en% de l’hémoglobine totale Stimulation et quantification des cytokines Un test de stimulation sanguine complète a été adapté pour évaluer la sécrétion de cytokines en réponse à un PPD de l’antigène M tuberculosis; l’antigène expérimental [Mycos Research], l’entérotoxine B staphylococcique SEB; le superantigène de contrôle positif [Sigma-Aldrich], ou pas d’antigène NEG; contrôle de fond des cytokines en présence d’anticorps co-stimulateurs CD et CDd [BD Biosciences]; Lors de l’obtention de l’échantillon sanguin de chaque patient, une série de préparations antigène-anticorps PPD, SEB et NEG, chacune dans un tube séparé, a été décongelée afin que des mL de sang par tube puissent être immédiatement ajoutés et mélangés doucement, Pour les concentrations finales de μg / mL de SEB, μg / mL de PPD et μg / mL de chaque anticorps Après incubation à ° C dans un bain-marie, les surnageants ont été récoltés et conservés congelés en aliquotes à – ° C. La quantification de IFN-y, IL-ß et IL- a été réalisée avec l’utilisation d’ELISA OptEIA; BD Biosciences, et la quantification de IL-, IL-, IL-, IL-, IL-, IL-, TNF-α, et de monocytes-granulocytes CSF a été réalisée avec l’utilisation du kit multiplex ELISA LINCOplex; Millipore dans un lecteur Luminex Classification LuminexDiabetes Hyperglycémie définie comme un taux de glucose à jeun ⩾ mg / dL ou un niveau de glucose aléatoire ⩾ mg / dL a été estimée en utilisant un glucomètre à main AccuCheck Advantage [Roche] sur des échantillons de sang anticoagulés EDTA le diabète, y compris les patients avec un diabète autodéclaré et / ou les patients recevant un traitement antidiabétique ou des patients non diabétiques mais présentant une hyperglycémie au diagnostic ont été classés comme diabétiques En accord avec les directives nationales actuelles et en tenant compte de l’âge du patient Analyse des données L’analyse des données a été effectuée à l’aide de SAS, version SAS. Les réponses cytokiniques aux antigènes ont été ajustées en soustrayant le niveau de fond de chaque cytokine NEG de SEB ajusté SEB, défini comme SEB moins NEG ou PPD ajusté PPD, défini comme PPD moins NEG Analyse univariée a été effectuée par χ test si n était & gt; personnes par groupe ou test exact de Fisher si n était ⩽ personnes par groupe pour les variables dichotomiques et par test de Kruskall-Wallis pour les variables continues Les modèles linéaires multivariés ont été construits pour tester l’association entre les niveaux de cytokine la variable dépendante et les principaux groupes de comparaison. niveau La transformation logarithmique naturelle de la valeur ajustée pour chaque cytokine en réponse à la PPD a été réalisée pour créer une distribution normale des niveaux de cytokine avant de conduire des régressions P linéaires multiples & lt; ont été considérés comme statistiquement significatifs

Résultats

Caractéristiques des patients atteints de tuberculose Soixante-huit patients atteints de tuberculose répondaient à nos critères d’inclusion Deux patients présentant des taux élevés d’HbAc mais aucun autre signe de diabète ont été exclus Les caractéristiques des patients restants sont présentées dans le tableau Vingt-neuf pour cent ont le diabète. % de tous les patients; % des patients diabétiques avaient des niveaux élevés de HbAc, indiquant une hyperglycémie chronique Presque tous ces patients étaient non noirs Hispaniques Mexicains Américains Nous avons évalué les différences entre les participants en ce qui concerne le diabète et le statut HbAc, qui étaient nos variables d’intérêt. groupes en ce qui concerne le sexe et le bacille Calmette-Guérin vaccination histoire Autrement, les groupes ne différaient pas en ce qui concerne les caractéristiques sociodémographiques et les symptômes de la tuberculose, y compris la fièvre, les frissons, la toux et la toux productive; données non présentées Comme prévu, l’indice de masse corporelle moyen, les niveaux d’HbAc, les taux d’insuline et le taux d’hyperglycémie étaient significativement plus élevés dans le groupe de patients diabétiques que dans le groupe de patients diabétiques. avec un groupe de patients qui avaient des niveaux normauxDescription des réponses cytokines Stimulation avec le superantigène SEB a servi de contrôle positif pour s’assurer que les conditions de stimulation lymphocytaire étaient appropriées Tous les participants avaient au moins le niveau de cytokine & gt; pg / mL en réponse à SEB ie, SEB ajusté, indiquant que WBCs étaient viables et capables de répondre à un stimulus antigénique données non montrées La réponse à la PPD antigène mycobactérienne expérimentale, PPD ajusté, a été évaluée chez tous les participants en mesurant les niveaux de cytokines. Dans notre étude, les cytokines étaient généralement classées comme IL-β, IL-, TNF-α, IL- et monocytes-granulocytes-CSF, IL-, IL- et IFN-γ, ou IL-, IL- , et IL- pour fournir une image globale du type de réponse dans chacun des groupes d’étude Cependant, nous réalisons que cette classification est une simplification excessive de la complexité des réponses immunitaires, avec certaines cytokines participant à & gt; type de réponse Plus de% des participants avaient un niveau de cytokine de réponse détectable, & gt; pg / mL à toutes les cytokines innées testées, ainsi qu’à l’IFN-γ, l’IL- et l’IL- En revanche, les réponses IL-, IL- et IL- n’ont été détectées qu’en%,% et% des participants, respectivement [tableau A]] en ligne seulement Parce que la réponse à IL- et IL- n’était pas mesurable chez>% des participants, et parce qu’il n’y avait aucune différence entre les données du groupe d’étude diabète ou HbAc non montrées, ces cytokines n’ont pas été évaluées Parmi les caractéristiques de l’hôte non liées au diabète, l’âge, le sexe, le pays d’inscription du patient, le résultat du frottis, la durée du traitement, et historique de la vaccination par bacille de Calmette-Guérin, le pays d’enrôlement était la caractéristique la plus fréquemment associée aux changements dans l’expression des cytokines. D’autres facteurs hôtes non diabétiques montraient des associations aléatoires avec les taux de cytokines. Les taux de HbAc, l’hyperglycémie et l’indice de masse corporelle étaient fréquemment associés à l’expression des cytokines et présentaient des profils similaires de types de cytokines. Par exemple, les niveaux d’expression de IFN-γ, IL- et IL- n’étaient pas associés. Diabète seul a été associé à une altération de l’expression de moins de cytokines que le taux élevé d’HbAc. Ces données suggèrent que le diabète de type est associé au niveau et au profil des réponses cytokiniques au diabète et à l’hyperglycémie. M tuberculose PPD

Analyse de l’association entre la réponse des cytokines à la PPD et les caractéristiques des patients atteints de tuberculoseNature de l’association entre les cytokines et les HbAclevels Nous avons mené d’autres analyses en utilisant HbAc en raison de Nous montrons la relation entre HbAc et les niveaux d’expression des cytokines en réponse à PPD par des diagrammes de dispersion dans la figure. La réponse de plusieurs cytokines à PPD les données biphasiques pour le TNF-a, l’IL- et l’IFN-y sont présentées sur la figure A-C; les données pour IL-, monocyte granulocyte-CSF, et IL- ne sont pas montrées; Les patients atteints de tuberculose qui présentaient des taux d’HbAc ⩽% d’hémoglobine totale présentaient un niveau hétérogène d’expression des cytokines, tandis que les patients tuberculeux ayant des taux élevés d’HbAc étaient des cytokines «élevées». Ce modèle contrastait avec celui observé pour les réponses cytokiniques au PPD. il n’y a pas d’association avec un taux élevé d’HbAc, comme dans le cas de l’IL – figure D Les associations significatives sont indiquées dans [l’annexe] [l’annexe] [le tableau A]; En ligne seulement Ensemble, ces données suggèrent que le taux d’HbAc est associé au niveau et au profil des réponses cytokiniques à M tuberculosis PPD

Figure Vue détailléeDimension de l’hémoglobine glycosylée Taux d’hémoglobine exprimée en pourcentage de l’hémoglobine totale, par rapport à la réponse cytokinique à la PPD pour les cytokines sélectionnées Chaque cercle représente un patient, avec des cercles noirs représentant des patients diabétiques et des cercles ouverts représentant des patients non diabétiques. niveau de la cytokine médiane La ligne verticale au niveau HbAc de% de l’hémoglobine indique les limites supérieures du niveau normal de HbAc gauche et élevée. Les valeurs de cytokine sont fournies par les valeurs logarithmiques naturelles P de l’échelle Ln pour l’association entre les valeurs de cytokines ci-dessus et Taux d’hémoglobine glycosylée, exprimée en pourcentage de l’hémoglobine totale, par rapport à la réponse cytokinique à la PPD pour les cytokines sélectionnées Chaque cercle représente un patient, avec des cercles noirs représentant les patients atteints de diabète et des cercles vides représentant la pat Les lignes horizontales indiquent le niveau médian de cytokine. La ligne verticale au niveau HbAc du% d’hémoglobine totale indique les limites supérieures du niveau normal de HbAc gauche et élevée. Les valeurs de cytokine sont fournies dans les valeurs logarithmiques naturelles P de l’échelle Ln pour l’association entre Évaluation multivariée des réponses cytokiniques par le diabète et HbAcstatus Nous avons conduit plusieurs modèles de régression linéaire pour établir si le diabète et le contrôle du diabète pauvre, comme indiqué par le taux d’HbAc, étaient associés à la réponse de chaque cytokine à PPD après contrôle des variables de confusion potentielles Les variables indépendantes entrées dans les modèles incluaient le diabète ou le taux d’HbAc, selon le modèle testé, avec l’âge et le sexe, ainsi que tous les autres facteurs de l’hôte liés à une cytokine donnée Variable dépendante de la réponse Pour nous assurer que nous n’avons manqué aucun autre p Nous avons utilisé une valeur de P ⩽ par analyse univariée comme notre niveau d’inclusion. Le niveau d’HbAc a été évalué comme une variable continue pour obtenir une puissance d’analyse maximale. Nous avons ensuite procédé à une suppression progressive des variables indépendantes avec les valeurs P les plus élevées. laissant dans le modèle final soit le diabète soit le taux d’HbAc selon le modèle et toutes les caractéristiques de l’hôte avec P⩽ La réponse à la PPD était significativement plus grande pour les cytokines favorisant ou médiant directement l’immunité à médiation cellulaire, y compris le TNF-α, monocyte granulocyte-LCR, IFN -γ, et IL- chez les patients diabétiques par rapport aux patients sans diabète ou chez les patients avec des taux élevés d’HbAc par rapport aux patients avec des taux d’HbAc normaux. En outre, les patients avec des taux élevés d’HbAc ont également exprimé des niveaux d’IL-β significativement plus élevés. à PPD chez les patients atteints de diabète ou de taux élevés de HbAc a été régulée à la hausse pour les cytokines innées et de type, mais pas pour les cytokines de type

Table View largeTélécharger la diapositiveMultivarié modèle pour chaque cytokine en réponse à PPD, par statut diabétique ou hémoglobine glycosylée HbAc niveauTable Voir grandTélécharger slideModèle multidimensionnel pour chaque cytokine en réponse à la PPD, par statut diabétique ou taux d’hémoglobine glycosylée HbAc

Discussion

, parce que les patients diabétiques sont plus sensibles à la tuberculose Une explication possible est que les patients diabétiques présentent des altérations dans la transduction du signal en aval des cytokines clés de réponse immunitaire Th et innée, probablement à la suite d’une augmentation des produits terminaux de glycation avancée. fonction protéique Ceci pourrait entraîner la suppression des réponses en aval qui sont critiques pour l’élimination de M tuberculosis malgré des niveaux élevés de cytokines protectrices et / ou l’accumulation de cytokines dysfonctionnelles dans le plasma dues à la modification avancée des produits de glycation. induire des régulateurs de rétroaction négative, par exemple, suppresseur de la signalisation des cytokines qui contrôlent normalement leur expression ou une demi-vie accrue des cytokines due à la protéolyse retardée résultant de la liaison des produits terminaux de glycation avancée concentration. cytokines de type en raison de bactéries plus élevées Comme le montre le modèle murin de la tuberculose et du diabète chronique Aux stades précoces de l’infection tuberculeuse chez la souris, comparable à une période bien avant que le patient consulte le médecin, les souris atteintes de Production d’IFN-γ Cependant, au fil du temps, les souris atteintes de diabète ont développé des niveaux plus élevés d’IFN-γ et de charges bactériennes dans les poumons, probablement à cause d’un stimulus antigénique plus élevé. une clinique de tuberculose Malheureusement, notre outil pour évaluer la charge bactérienne chez les patients est le frottis direct, qui est insensible et imprécis. Dans une étude rétrospective antérieure impliquant & gt; patients atteints de tuberculose, nous avons montré que ceux qui avaient un diabète autodéclaré présentaient une fréquence significativement plus élevée de frottis positifs Avec un nombre limité de cas disponibles pour une analyse prospective, nous n’avons pas encore observé de différence statistiquement significative dans la proportion de patients diabétiques avec des résultats de frottis positifs% dans le groupe de patients diabétiques et% dans le groupe de patients non diabétiques; L’interprétation de la signification des taux de cytokine régulés chez les patients diabétiques par rapport à la tuberculose doit être faite avec un esprit ouvert. Premièrement, nos études ont uniquement évalué la réponse à la PPD, et l’immunité contre M tuberculosis in vivo est bien connue. Deuxièmement, nous avons sélectionné des patients atteints de tuberculose qui n’avaient pas de diabète ou d’infection par le VIH comme sujets témoins, car ils constituaient le meilleur groupe à comparer avec les patients. Nous reconnaissons que nos sujets témoins comprennent un groupe hétérogène d’individus également «sensibles» à la tuberculose. Enfin, nous sommes conscients que les réponses immunitaires locales des organes et du système peuvent être liées, mais nos observations de la réponse périphérique doivent être extrapolées avec prudence. événements dans le site primaire de l’infection, le poumonDeux études précédentes impliquant des patients atteints de tuberculose ont signalé une association Contrairement à nos résultats, ces deux études suggèrent des niveaux plus faibles d’IFN-γ en réponse aux antigènes M tuberculosis chez les patients diabétiques. Un examen plus approfondi des données dans ces études conduit à Dans les études publiées , le sang ou les PBMC ont été dilués dans des milieux de culture cellulaire avant stimulation lymphocytaire. Dans notre étude, les lymphocytes ont été stimulés dans le sang total, préservant l’environnement de la glycémie et d’autres facteurs plasmatiques. Nous avons ensuite ajouté des anticorps co-stimulateurs pour stimuler les réponses des lymphocytes T mémoire Deuxièmement, notre population étudiée était hispanique, et les différences ethniques génétiques peuvent également être importantes Troisièmement, différents antigènes mycobactériens ont été utilisés pour la stimulation Quatrièmement, il pourrait y avoir des différences dans le niveau de contrôle de la glycémie entre les populations étudiées Enfin, nous avons inclus les patients ayant reçu jusqu’à plusieurs jours de traitement Ce manque de compréhension de ces variations apparentes entre les études illustre la faible connaissance des bases biologiques de l’association tuberculose-diabète. , nous avons développé un système in vitro pour détecter les différences dans la réponse immunitaire à M tuberculosis chez les patients diabétiques et avons déterminé que le prédicteur le plus sensible des différences détectables est l’hyperglycémie chronique. Ces données fournissent la base pour des études supplémentaires sur des voies spécifiques. est d’avoir une compréhension précise des événements cellulaires et moléculaires qui sous-tendent l’association entre la tuberculose et le diabète

Remerciements

Nous remercions Diana Gomez, Perla Martinez et Dr Kristy Murray, pour leur soutien technique; Izelda Zarate, pour la coordination sur le terrain; et Drs Gonzalo Crespo et Ricardo Avila-Reyes, pour le soutien logistique au Secrétariat de Salud de Tamaulipas. Soutien financier Instituts nationaux de la santé NIH P MD- et NIH URR-, Université du Texas Health Science Center à Houston, École de santé publique PRIME-UTHSC -H, et Borderplex UTHSCH-UTB-UT-PANAMPcontrôles d’intérêts potentiels Tous les auteurs: aucun conflit