"Dan Ferro has taught some of the most
important singers of the 20th Century"
Brian Zeger - The Juilliard School
The Metropolitan Opera

"Intensive study of vocal technique as applied to the literature for active singers"

Structure de la population génétique des staphylocoques à coagulase négative associés au transport et à la maladie chez les nourrissons prématurés

Les staphylocoques à coagulase négative sont une cause majeure de septicémie dans le service néonatal de soins intensifs. Pour évaluer l’hypothèse selon laquelle les isolats de CoNS associés à la maladie appartiennent à des clones hypervirulents, plutôt que d’être prélevés au hasard sur la flore une étude prospective cas-contrôlée dans un USIN occupé pulsé électrophorèse en champ pulsé PFGE, nous avons comparé les structures de population des isolats de CoNS associés à la bactériémie avec des isolats de la peau de nouveau-nés sains et infectés et avec des contaminants de la culture hémisphérique clones endémiques de CoNS identifiés, mais il n’y avait pas de différence dans la distribution des espèces ou des types de PFGE entre les groupes de transport et d’isolement de la maladie; cela suggère que les clones hypervirulents avec une capacité accrue à provoquer la maladie n’étaient pas présents dans ce contexte de l’USIN

Les staphylocoques à coagulase négative sont les principales causes de septicémie à début tardif chez les nourrissons prématurés Le risque d’infection est inversement proportionnel à l’âge gestationnel et au poids à la naissance, avec environ chez les nouveau-nés de très faible poids à la naissance. g développant un épisode de bactériémie CoNS l’infection par CoNS dans ce contexte est associée à une augmentation significative de la morbidité et de la mortalité , de la durée du séjour [,,] et du coût global du traitement Réduire le taux de septicémie, qui dépend en partie du développement d’une compréhension en profondeur des déterminants de l’infection par CoNS. Le profil clinique de la maladie CoNS indique que la réponse immunitaire de l’hôte est un déterminant important de l’infection. , mais ces infections sont généralement associées à du matériel prothétique et sont typiquement localisées et indolentes L’infection systémique est rare et implique souvent les espèces les plus pathogènes du groupe, par exemple l’endocardite à valve native causée par Staphylococcus lugdunensis . le profil de la maladie chez les individus ayant une immunosuppression sévère, comme ceux qui subissent une chimiothérapie pour hématologie et Les néphropathies sont une cause majeure de septicémie dans ce groupe, souvent en association avec un dispositif intraveineux La réponse immunitaire immature chez les nouveau-nés prématurés peut expliquer en partie pourquoi ces patients sont sujets à une infection par CoNS. Trois études menées en dehors de l’unité néonatale de soins intensifs néonatals ont comparé des collections de souche inégalées de Staphylococcus epidermidis associées au portage et à l’infection et ont rapporté que l’opéron ica était détecté plus fréquemment dans les isolats associés à la maladie [ -] Cet opéron code un exopolysaccharide appelé «adhésine intercellulaire polysaccharidique», impliqué dans la formation de biofilms La production de biofilm est largement considérée comme un déterminant important de virulence dans la maladie de CoNS , mais tous les isolats associés à la maladie ne produisent pas de biofilm. vitro Cela implique que l’infection implique probablement une combinaison de facteurs plutôt que Un seul déterminant L’étude de ce processus complexe nécessite une approche de préférence sans hypothèse et qui évalue plusieurs facteurs bactériens. Une stratégie possible consiste à déterminer si les isolats invasifs constituent des clones hypervirulents, confirmant ainsi le rôle des facteurs bactériens dans la maladie. clones fournit un cadre pour de futures études de déterminants de virulence, dans lesquels les compléments génétiques de souches invasives et moins pathogènes peuvent être comparés Plusieurs études ont entrepris le génotypage de CoNS isolé à partir d’échantillons de sang obtenus de nouveau-nés pour la culture. Cependant, on ne sait pas si cela reflète une pathogénicité relativement plus élevée de ces clones par rapport à d’autres ou une prépondérance de ces clones dans la population de porteurs de bactéries néonatales. Le but de cette étude était de e Valoriser l’hypothèse que les isolats de CoNS associés à la maladie appartiennent à des clones hypervirulents, plutôt que d’être prélevés au hasard sur les souches qui colonisent les nouveau-nés dans l’unité. Ceci a été réalisé dans une étude prospective cas-contrôlée dans laquelle CoNS qui causaient bactériémie utilisation de l’électrophorèse sur gel en champ pulsé PFGE avec des isolats de la peau de nouveau-nés sains et infectés et avec des contaminants de la culture de sang

Méthodes

Conception de l’étude cas-témoins L’étude a été menée prospectivement à l’USIN de John Radcliffe Hospital, Oxford, Royaume-Uni, de mai à juillet. Cette unité a la capacité de prendre soin des nouveau-nés, de recevoir des soins intensifs et de recevoir des soins hautement dépendants. Les échantillons de sang pour la culture ont été prélevés sur des sites périphériques plutôt que sur des lignées précédemment placées. La pertinence clinique des hémocultures positives a été évaluée au cours de réunions régulières entre le personnel de la salle et de l’étude, au cours de laquelle des informations cliniques et microbiologiques ont été examinées Les isolats de culture hématologique ont été classés dans les catégories «isolats invasifs» ou «contaminants», sur la base d’un tableau de critères prédéfinis. Données démographiques et cliniques enregistrées pour les nouveau-nés atteints de bactériémie CoNS sexe, âge gestationnel, poids à la naissance, âge à la collecte de l’échantillon, p osition dans la zone de soins intensifs ou de dépendance élevée de l’USIN, durée totale du séjour à l’USIN et résultat final

Initialement, les flacons hospitaliers John Radcliffe ont été incubés pendant plusieurs jours sur le système Bactec Becton Dickinson et sous-cultivés selon les procédures opératoires standard du laboratoire s’ils étaient marqués comme positifs pendant cette période. Le personnel de l’étude a assuré la liaison quotidienne avec le département de microbiologie. Les plaques inoculées à partir de cultures sanguines et de prélèvements cutanés ont été examinées visuellement pour identifier les staphylocoques présomptifs sur la base de la morphologie coloniale. Chaque variante coloniale a été initialement traitée comme une souche différente et a été plaquée à la pureté sur le sang. agar et incubées à ° C dans l’air pour h Colonies de morphologie différente sur un seul spécimen, trouvées plus tard sur biotypage et génotypage identiques, ne sont comptées qu’une seule fois dans l’analyse Pour évaluer si les colonies de même morphologie sur une plaque donnée étaient les même souche, colonies avec l’apparence identique wer Ces colonies ont été typées par PFGE en utilisant la méthodologie décrite ci-dessous. Les profils de bandes étaient identiques pour les colonies qui avaient un aspect identique sur la même plaque. Données non représentées Des isolats ont été prélevés sur chacune des plaques de gélose au sang. identifié comme CoNS sur la base d’un résultat positif au test de catalase et de résultats négatifs au test de coagulase et DNase L’identification au niveau de l’espèce a été réalisée par le système API ID bioMérieux UK Ltd, selon les recommandations du fabricant. La sensibilité a été testée à la pénicilline, l’oxacilline, la gentamicine, la nétilmicine, l’amikacine, l’érythomycine, la tétracycline, la ciprofloxacine, la vancomycine, l’acide fusidique, la rifampicine et le triméthoprime. bouillon de soja trypticase avec glycérol% en volume à – ° CPF La préparation d’ADN chromosomique pour PFGE a été réalisée comme décrit ailleurs mais avec les modifications suivantes. Des isolats bactériens ont été cultivés sur gélose au sang pendant une nuit à ° C dans l’air. Des blocs de gel ont été fabriqués en utilisant des volumes égaux de% d’agar à bas point de fusion Gibco et une suspension bactérienne de cellules x La lyse cellulaire bactérienne a été réalisée par utilisation de lysostaphine U / mL Ambi et lysozyme μg / mL SigmaDNA a été digéré par SmaI New England BioLabs PFGE a été réalisée avec l’utilisation d’un gel d’agarose% Gibco dans un CHEF Système DRIII Bio-Rad dans les conditions suivantes: durée de fonctionnement, h; température, ° C; tension, V; temps initial d’avance, s; Les New England BioLabs Gels ont été colorés avec du bromure d’éthidium, lavés à l’eau et photographiés sous ultraviolets à l’aide du système Gel Doc Bio-Rad Les images stockées ont été analysées par des observateurs. de BioNumerics, la version Applied Maths PFGE types ont été définis sur la base du motif de bandes d’ADN, et les isolats avec des modèles identiques ont été considérés comme «génotypiquement indiscernable»; “Liés”, s’ils différaient par des bandes; et «non apparentés», s’ils différaient par ⩾ bandesAnalyse statistique Il y avait des populations d’isolats de CoNS provenant de cette étude cas-témoin: isolats hématophages invasifs, isolats sanguins considérés comme contaminants, isolats cutanés chez les patients indexés et isolats cutanés Les isolats invasifs de chaque patient cas index ont été associés à des isolats ⩾ de la peau de l’index bébé et ⩾ isolats. Chez chacun des bébés contrôles appariés Ces isolats ont été considérés comme appartenant à une strate identifiée par le patient index. Dans la culture hématogène des strates, les témoins sains du nourrisson et les témoins bébés malades, les souches ont été identifiées sur la base du biotypage pour spéciation, type PFGE, et antibiogramme Le sujet de toutes les analyses ultérieures était la souche, plutôt que l’isolat, parce que, dans de Les isolats de la même source étaient identiques et représentaient la même souche. Les analyses génétiques de population ont été effectuées dans et entre les groupes d’isolats, et les analyses de «transmission» ont été effectuées dans les strates de patients appariées temporellement. La distribution des espèces entre les groupes a été comparée dans un simple tableau de contingence La diversité génétique définie par le nombre de différents types de PFGE a été comparée entre les groupes. Comme mesure de la diversité génétique pondérée pour la fréquence de la souche, des isolats avec des types PFGE identiques consécutifs de chaque population ont été calculés, avec des IC binomiaux exacts; cette probabilité a ensuite été comparée entre les groupes Aucun ajustement systématique pour les comparaisons multiples n’a été utilisé

Résultats

Patients et contrôles

Quatorze de ces épisodes ont été considérés comme une «bactériémie à CoNS définie» et comme une «bactériémie à CoNS probable». Ces cas ont été regroupés aux fins d’analyses. Un ensemble complet a été utilisé pour le traitement de l’infection par staphylocoques à coagulase négative. des prélèvements de contrôle du patient cas index et des contrôles sains appariés ont été collectés pour ces cas. Chaque ensemble d’isolats de maladie lié à la temporalité plus des témoins représente un groupe séparé ou une strate aux fins de cette analyse. En outre, les isolats de CoNS d’un total de nouveau-nés ont été considérés comme des hémocultures. Deux de ces nouveau-nés ont également donné des isolats d’hémocultures «vrais positifs» et sont inclus dans les cas de référence.Les données démographiques du nouveau-né et du nouveau-né sont résumés dans le tableau Il n’y avait pas de différence significative s dans le sexe, l’âge gestationnel, le poids à la naissance ou le moment de l’échantillonnage entre les groupes cliniques Malgré cela, les nouveau-nés avec une bactériémie CoNS étaient significativement plus susceptibles d’être dans la zone de soins intensifs dans l’USIN P & lt; et ont eu un séjour significativement plus long dans l’USIN P = que les nouveau-nés témoins et ceux ayant des hémocultures contaminées

Table View largeTélécharger les données démographiques des patients atteints de bactériémie, de contrôles et de personnes ayant des hémocultures contaminéesTable View largeTélécharger les données démographiques des patients atteints de bactériémie, de contrôles et d’individus ayant des hémocultures contaminées

Isoler les espèces et l’antibiogramme

Six espèces de CoNS étaient représentées parmi les isolats Les groupes les plus importants étaient S epidermidis et Staphylococcus capitis, qui représentaient respectivement% et% des isolats. Il n’y avait pas de différence significative dans la distribution des espèces entre les groupes cliniques P =; tableau Il y avait une répartition égale de S epidermidis parmi les groupes P = et entre les isolats de peau et de sang% vs%, respectivement; P =

DiapositivesDistribution des espèces d’isolats de staphylocoques à coagulase négative CoNSTable View largeDownload slideDistribution des isolats de staphylocoques CoNS à coagulase négativeComme dans les études précédentes sur les isolats de CoNS provenant d’unités de soins intensifs néonatals, il y avait un niveau élevé de résistance aux antibiotiques dans cette étude. Tous les isolats étaient sensibles à la vancomycine Des souches de la peau ou du sang de nouveau-nés malades étaient résistantes à une médiane d’antibiotiques intervalle interquartile, -, comparé à une médiane de gamme interquartile, – antibiotiques pour souches provenant de la peau de témoins sains du test de Kruskal-Wallis Pour la plupart des antibiotiques individuels testés, il n’y avait pas de différence significative entre les groupes cliniques et la résistance aux antibiotiques n’était pas associée au groupe isolat pathogène. Cependant, la résistance à la gentamicine et au triméthoprime était significativement plus élevée chez les isolats des patients cas de référence causant la bactérie Dans les deux cas, cela n’a pas pu être expliqué par une inadéquation entre les cas et les témoins en termes de durée d’admission ou d’antibiotiques administrés avant l’isolement bactérien. Cependant, ces résultats peuvent représenter une découverte fortuite en raison des comparaisons multiples faites

Tableau View largeDownload slideRésistance anti-biotique par groupe cliniqueTable Voir grandDownload slideAntibiotique résistance par groupe clinique

Types de PFGE

PFGE des isolats a donné des types distincts tous différents les uns des autres par & gt; bandes Tous les types de PFGE étaient uniques à une espèce particulière, et toutes les espèces sauf S capitis étaient représentées par plusieurs types Huit types avaient des sous-types qui différaient les uns des autres dans un type par – bandes

Analyse de cas-contrôle

Dans les strates, les isolats invasifs présentaient des types de PFGE identiques à ⩾ des témoins sains dans les cas et à la flore cutanée du cas index dans les cas P = Dans une strate, le type pathogène était présent dans les deux groupes témoins. que, bien que les types invasifs étaient répandus comme la flore cutanée dans l’USIN au moment de l’infection, le patient de référence n’était pas plus susceptible d’être colonisé avec la souche causant sa maladie que les témoins sains

Diversité génétique

Les espèces S capitis étaient significativement moins diversifiées que les autres espèces, tous les isolats étant affectés à un seul type de PFGE avec des sous-types; figure Les isolats de S epidermidis ont été répartis entre les types de PFGE, bien que plus de la moitié des isolats étaient représentés par le plus répandu de ces types

Figure Vue largeDownload slide Représentation graphique de l’électrophorèse en champ pulsé Résultats PFGE et biotypage des espèces de Staphyloccus qui montrent l’abondance relative de chaque espèce et leur diversité génétique Le diagramme circulaire représente la fréquence relative de chaque espèce parmi les isolats de l’étude port, bactériémie et Les couleurs génotypiques ne sont significatives que dans chaque camembert des espèces, car tous les génotypes sont uniques à une seule espèce.Figure Vue largeDownload slideD représentation graphique de l’électrophorèse sur gel à champ pulsé PFGE et résultats du biotypage des espèces de Staphyloccus qui montrent l’abondance relative de chaque espèce et leur diversité génétique Le diagramme circulaire central représente la fréquence relative de chaque espèce parmi les isolats de l’étude transport, bactériémie et souches contaminantes mises en commun. Fréquences latentes de chaque clone de PFGE dans chaque espèce Les couleurs de génotype n’ont d’importance que dans le graphique circulaire de chaque espèce, car tous les génotypes sont uniques à une seule espèce

Tableau View largeTableau de téléchargementNombre d’électrophorèse sur gel à champ pulsé par type d’espèceTable View largeDownload slideNombre d’électrophorèse sur gel à champ pulsé Types de PFGE par espèceClans cliniques Il n’y avait pas de différence significative entre les groupes quant au nombre de types PFGE par isolat et la probabilité de prélèvement aléatoire isole avec le même type Ceci suggère que les populations sont également génétiquement diverses figure; table

Figure Vue grandDownload slide Représentation graphique des types d’électrophorèse en champ pulsé distribués parmi les groupes d’isolats cliniques issus de l’étude cas-témoins Chaque génotype est représenté par une couleur unique, de sorte que les proportions relatives dans chaque groupe clinique peuvent être vues. des types d’électrophorèse sur gel à champ pulsé répartis parmi les groupes d’isolats cliniques dérivés de l’étude cas-témoins Chaque génotype est représenté par une couleur unique, de sorte que les proportions relatives dans chaque groupe clinique peuvent être vues

Table View largeTableau de téléchargementNombre d’électrophorèse en champ pulsé par groupe clinique et probabilité de choisir des types identiquesTable View largeDownload slideNombre d’électrophorèse en champ pulsé par type clinique et probabilité de choisir des types identiquesLa distribution de fréquence des types de PFGE n’était pas plat, parce que certains types étaient beaucoup plus communs que d’autres Les types d’ECP les plus nombreux représentaient% des isolats. Ces types communs n’étaient pas plus susceptibles de causer une maladie invasive; ils étaient également répartis entre les groupes cliniques, avec les types PFGE survenant dans tous les groupes

Discussion

dy était jugé irréalisable; même si l’infection par CoNS est un problème majeur dans les soins intensifs néonatals, un très grand nombre de nourrissons devraient être recrutés pour un nombre raisonnable de cas à identifier prospectivement. La PGEF est largement utilisée pour comparer les isolats staphylococciques épidémiologiquement apparentés. considéré comme la méthode de choix pour l’étude de la microépidémiologie de CoNS sur une unité de soins intensifs néonatals D’autres investigateurs ont utilisé avec succès le PFGE pour identifier des clones de CoNS dans le même cadre Bien que le PFGE d’un clone donné devienne divergent ou la distance géographique, nous avons supposé qu’une telle divergence serait limitée dans un seul environnement clos pendant une courte période de temps. L’une des limites du PFGE est qu’il n’y a pas de relation prévisible entre les différences de bande entre les isolats et les changements génétiques qui les provoquent. différences Pour cette raison, nous avons évité les techniques d’analyse, telles que le groupe de paires non pondérées avec une moyenne arithmétique en grappes et une analyse en composantes principales, qui dépendent d’un traitement numérique des différences de motifs de bandes Une autre limitation de l’ECPP est qu’elle peut être trop ou sous-discriminatoire, conduisant à une incapacité à résoudre la clonalité dans un isolat dispersé géographiquement et temporellement. Populations Les deux problèmes susmentionnés peuvent être surmontés en utilisant des techniques qui génèrent des ensembles de données de multiples caractéristiques discrètes qui varient indépendamment, telles que l’électrophorèse enzymatique multilocus et MLST. Elles sont bien adaptées à l’étude de la clonalité bactérienne et ne dépendent pas du fragment de restriction. polymorphismes de longueur, mais ils n’ont pas encore été décrits pour l’étude des espèces de CoNS. Les clones endémiques ont été démontrés dans la présente étude, l’exemple le plus marqué étant un seul clone de S capitis contenant des isolats associés à une bactériémie. n’a pas eu de canules veineuses du cuir chevelu, et le cuir chevelu était rarement Utilisé comme site d’accès iv pendant l’étude S capitis n’est pas un agent pathogène nosocomial commun, et en tant qu’espèce, il n’a pas été démontré qu’il était surreprésenté dans la flore des autres unités échantillonnées. Cependant, son existence est cohérente avec les rapports précédents de l’unité. clones endémiques spécifiques de CoNS, y compris S epidermidis et S haemolyticus [,,] La découverte que S epidermidis était représenté par un grand nombre de clones dans notre unité, mais que plus de la moitié de tous les isolats appartenaient à des clones, est également similaire à Les études antérieures ont montré que les profils de résistance antimicrobienne des clones endémiques à des unités particulières ont reflété l’utilisation d’antibiotiques dans cette unité , mais la relation entre la résistance aux antibiotiques et la pathogénicité dans le contexte de l’USIN n’est pas claire. d’isolats du sang ou de la peau de nourrissons malades présentant une flore cutanée provenant de témoins en bonne santé ont démontré que les nouveau-nés malades étaient significativement plus susceptibles d’être colonisés par le CoNS t Si les enfants malades étaient manipulés à une intensité plus élevée que les témoins sains, une explication possible est que les isolats plus résistants sont portés plus fréquemment sur les mains du personnel. Aucune association n’a été démontrée entre les antibiotiques. résistance et pathogénicité accrue Six espèces d’isolats de CoNS ont été trouvées sur la peau des nouveau-nés de l’USIN, représentées par des souches multiples. En tenant compte de leurs fréquences relatives dans la population de paniers, ces espèces étaient également susceptibles de causer des maladies. Dans notre étude, il n’y avait pas de différence de potentiel pathogène entre ces espèces de CoNS. Notre constatation que les souches de CoNS associées à une maladie invasive étaient représentées également dans la population de patients indique que les clones hypervirulents de CoNS n’étaient pas présents dans l’USIN d’Oxford au moment de l’étude. Ainsi, les génotypes de CoNS et les phénotypes associés qui prospèrent dans notre NI Les UC ne sont pas associées à une pathogénicité accrue Ceci n’exclut pas la possibilité que les déterminants de virulence soient hautement conservés parmi les isolats associés au portage et à la maladie. Il est également cohérent avec l’idée que les CoNS sont des agents pathogènes purement opportunistes chez les nouveau-nés prématurés. déterminants critiques de l’infection Bien que nous n’ayons pas démontré de clones hypervirulents dans notre unité, il est possible qu’ils soient présents en tant que minorité d’isolats invasifs et n’aient pas été détectés par une étude de cette taille Pour cela, la majorité des les isolats proviendraient de clones sporadiquement rencontrés, rendant les clones hypervirulents relativement peu importants dans la pathogenèse de la maladie CoNS Il est possible que PFGE soit un outil inadéquat pour détecter les clones hypervirulents, pour les raisons discutées ci-dessus. Nous développons actuellement un schéma MLST pour S epiderimidis qui sera appliqué pour répondre à cette possibilité

Reconnaissance

Nous tenons à remercier le personnel médical et infirmier de l’unité de soins intensifs néonatals, Hôpital John Radcliffe, Oxford |

Infections à Rhodococcus equi chez les hôtes immunocompétents: rapport de cas et examen