"Dan Ferro has taught some of the most
important singers of the 20th Century"
Brian Zeger - The Juilliard School
The Metropolitan Opera

"Intensive study of vocal technique as applied to the literature for active singers"

Sélectivité et spécificité des ligands du récepteur de la sphingosine-1-phosphate: mises en garde et pensée critique dans la caractérisation des effets médiés par le récepteur

Les récepteurs du sphingosine-1-phosphate (S1P) ont été découverts et caractérisés vers la fin des années 90. Il y a dix ans, il n’y avait pas d’agoniste ou d’antagoniste sélectif du récepteur S1P. La suramine, un ancien médicament anti-protozoaire, a été utilisée comme antagoniste des récepteurs S1P3 (Ancellin et Hla, 1999, Salomone et al., 2003), mais son utilité était limitée car elle manquait de spécificité (Voogd et al., 1993). Récemment, un certain nombre de ligands pour les récepteurs S1P ont été criblés comme agonistes et antagonistes (Im, 2010). La plupart de ces agents nouvellement développés sont disponibles dans le commerce et sont de plus en plus utilisés pour caractériser les sous-types de récepteurs S1P impliqués dans des mécanismes et des fonctions biologiques spécifiques. Cependant, ils n’ont souvent pas été sélectionnés pour leur spécificité vis-à-vis d’un large éventail de cibles, et n’ont pas été systématiquement étudiés in vivo, comme cela est requis pour les médicaments destinés à l’usage humain.Par contre, des données pharmacologiques plus détaillées sont disponibles. potentiel thérapeutique.Parmi ceux-ci, le fingolimod (FTY720), un médicament approuvé par la FDA et l’EMA, mérite particulièrement d’être mentionné, car, une fois phosphorylé, il se lie à tous les récepteurs S1P sauf à S1P2 in vitro. In vivo, le phospho-fingolimod diminue la S1P1 lymphocytaire pour inhiber la signalisation et la sortie des lymphocytes S1P-S1P1 (Matloubian et al., 2004; Martin et al., 2010), qui induit une rémission chez les patients atteints de sclérose en plaques (Kappos et al. , 2010). Fingolimod a été testé contre un grand nombre d’autres cibles (y compris environ 100 récepteurs) pour assurer la spécificité du récepteur S1P (V. Brinkmann, Novartis Instituts pour la recherche biomédicale, communication personnelle) .Avec la plupart des autres récepteurs S1P disponibles, FTY720 a été utilisé dans un grand nombre de publications (près de 1000 publications indexées PubMed en janvier 2011). Probablement parce qu’il a fait l’objet d’un tel examen minutieux, d’autres effets du FTY720 induits par les récepteurs non-S1P ont été documentés. Par exemple, FTY720 inhibe la céramide synthase (Lahiri et al., 2009), la phospholipase cytosolique A2 (Payne et al., 2007), la lyase S1P (Bandhuvula et al., 2005), la sphingosine kinase (SPK) 1 ( Vessey et al., 2007; Tonelli et al., 2010), et la sphingomyélinase acide (Dawson et Qin, 2011), stimulent la production de 27-hydroxycholestérol (Blom et al., 2010), se lient aux protéines 14-3-3 et inhibent leur signalisation pro-survie (Woodcock et al., 2010). Parce que la plupart de ces effets ont été observés à une concentration relativement élevée de FTY720, ils peuvent ne pas être pertinents pour les effets in vivo du médicament. Mais les chercheurs doivent être prudents lorsqu’ils interprètent les résultats d’études in vitro, en particulier lorsque ces études utilisent des concentrations élevées de FTY720. Incidemment, le fait que le fingolimod ne fasse pas de discrimination entre les récepteurs S1P1, S1P3, S1P4 et S1P5 peut ne pas avoir d’importance in vivo. Parce que les niveaux sanguins de FTY720 sont faibles (< 3   nM), le médicament n'occupe pas les récepteurs S1P3 dans une mesure significative. Cependant, après la régulation négative des récepteurs S1P1, l'activation homéostatique de S1P2 et S1P3 par le plasma endogène S1P (> 200   nM) devient prédominante, et la balance de signalisation S1P est déplacée de S1P1 à S1P2 / S1P3, et ainsi de Gi à l’activation G12 / 13 / Rho / Rho kinase. La conséquence fonctionnelle observée de l’administration de FTY720 peut donc être une somme d’effets induits par la S1P médicamenteuse et endogène, et être très similaire aux agents sélectifs S1P1 et aux modulateurs S1P sélectifs non sous-type. Nous avons choisi de centrer cette perspective sur JTE-013 et BML -241 parce qu’ils sont couramment utilisés malgré les rapports de leur manque de spécificité. Nous discutons également VPC23019, pour lequel la preuve de l’activité de l’antagonisme des récepteurs S1P3 semble faible. JTE-013 a été développé par l’Institut Central de Recherche Pharmaceutique, Japan Tobacco Inc. Son brevet (Brevet WO 01/98301, 27 décembre 2001) a déclaré que JTE-013 inhibait la liaison spécifique de S1P radiomarquée aux membranes de cellules CHO transfectées avec des récepteurs S1P2 de rat, avec des valeurs IC50 de 17   ±   6 et 22      9   nM, et n’a pas affecté la liaison de S1P à S1P3 et S1P1 , à des concentrations allant jusqu’à 10   μ M (Osada et al., 2002; Ohmori et al., 2003). Sur la base de ces données, JTE-013 a été considéré depuis lors comme un ligand spécifique du récepteur S1P2 et, suite à d’autres données expérimentales, un antagoniste S1P2. Parce que JTE-013 a été utilisé pour caractériser la contraction de l’artère coronaire canine (Ohmori et al., 2003), nous l’avons utilisé dans des vaisseaux isolés de rongeurs pour évaluer le rôle des récepteurs S1P2 dans la vasoconstriction induite par S1P des artères basilaires (Salomone et al., 2008). Nous savions que la vasoconstriction induite par S1P a été abolie dans S1P3 − / − souris et ont donc été surpris de voir que JTE-013 inhibait la vasoconstriction à S1P dans les artères de souris de type sauvage, parce que cela suggérait que S1P2 au lieu de, ou en plus de S1P3 était médiant effet S1P. En étudiant plus loin, cependant, nous avons réalisé que JTE-013 inhibait la vasoconstriction non seulement à S1P, mais aussi à l’analogue de prostanoïde U46619, endothéline-1 et KCl élevé (Salomone et al., 2008), la vasoconstriction induite par récepteur à médiation mais apparenté aux canaux Ca2 + de type L). Nous avons ensuite effectué une expérience de contrôle génétique critique, et constaté que JTE-013 inhibait la vasoconstriction induite par S1P dans S1P2 − souris, démontrant que cet effet n’était pas lié aux récepteurs S1P2. Pourtant, JTE-013 est encore largement utilisé pour caractériser les effets dépendants de S1P2 (Table ​ (Table1) .1). Il convient de noter que la plupart des études validant les effets de blocage de S1P2 de JTE-013 utilisaient des concentrations égales ou inférieures à 1   μ M, alors que nous avons trouvé des preuves de non-spécificité à 10   μ M. Il est donc possible que JTE-013 conserve une sélectivité suffisante et reste un antagoniste utile dans la gamme submicromolaire, mais l’implication du récepteur S1P2 devrait être validée par d’autres moyens.Tableau 1 Certaines données publiées obtenues avec JTE-013 (parmi plus de 50 citations indexées PubMed) .BML-241 a été développé en même temps que JTE-013, par conception de médicaments rationnelle utilisant la structure de S1P pour interroger une base de données tridimensionnelle . Deux nouveaux composés ont été identifiés qui ont montré une activité antagoniste. Lorsque testé à 10   μ M, “ Composé 2 ” inhibée par des augmentations de [Ca2 +] i induites par 371 S1P dans les cellules HeLa exprimant les récepteurs S1P3 et d’environ 7% [Ca2 +] i augmente dans les cellules exprimant les récepteurs S1Pl (Koide et al., 2002). Fait frappant, cette étude était basée sur des mesures avec une seule concentration de BML-241 et la comparaison de seulement deux cibles potentielles (récepteurs S1P1 et S1P3) dans un essai; de plus, une inhibition de moins de 40% par une concentration d’antagoniste M de 10- dans la culture cellulaire pourrait être considérée comme moins impressionnante. Néanmoins, au moins 20 études (Tableau ​ (Tableau2) 2) ont été publiées en utilisant BML-241 (également connu sous le nom de CAY10444), la plupart après la publication d’un article montrant que BML-241 inhibe [Ca2 +] i via le récepteur P2 purinergique ou la stimulation des récepteurs 1A-adrénergiques et la contraction médiée par les récepteurs 1A-adrénergiques, sans affecter la diminution médiée par S1P3 de l’accumulation d’AMPc induite par la forskoline (Jongsma et al., 2006). Dans un tiers de ces études, BML-241 / CAY10444, testé à 1 ou 10   μ M, n’a eu aucun effet, conduisant les auteurs à conclure sur un manque d’implication des récepteurs S1P3 dans leur paradigme. Il est cependant possible que la concentration de BML-241 / CAY10444 utilisée dans ces études soit trop faible pour bloquer de façon significative les récepteurs S1P3; En effet, en utilisant un test de recrutement de β -arrestine, Wetter et al. (2009) ont montré que leur réponse de la lignée cellulaire S1P3 à S1P était inhibée à 78% de la réponse du récepteur par 100 MMLML-241 / CAY10444, avec une IC50 de 4,6 μ M. Une explication moins probable, mais possible, des études négatives avec BML-241 est qu’une action non spécifique du médicament peut avoir contrecarré le blocage partiel des récepteurs S1P3. À la lumière de la faible affinité de BML-241 / CAY10444 pour les récepteurs S1P3, il ne semble pas que les quelques études qui ont documenté un effet de l’antagoniste à 1 ou 5 M soient justifiées en ce qui concerne les récepteurs S1P3. Deux études utilisant des concentrations plus élevées de BML-241 / CAY10444 (50 et 100   μ M) ont observé un effet antagoniste agranulocytose. Dans l’une de ces études, l’agoniste S1P1 SEW2871 n’a eu aucun effet, alors que l’antagoniste du récepteur S1P1 / S1P3 VPC23019 a reproduit l’effet de BML-241 / CAY10444 (Lichte et al., 2008). Dans l’autre étude, la migration des cellules B a été favorisée par un agoniste du récepteur S1P1 / S1P3 mixte (VPC24191), mais pas par l’agoniste S1P1 SEW2871. En outre, les cellules B de S1P3 + / − les souris migraient vers S1P, tandis que les cellules des souris knock-out S1P3 étaient incapables de migrer vers S1P à toutes les concentrations de S1P testées (Donovan et al., 2010). Fait intéressant, dans cette étude, la migration des lymphocytes B n’était que légèrement et pas significativement inhibée par BML-241 / CAY10444, testée à une concentration aussi élevée que 100   μ M.Table 2Données obtenues avec BML-241 / CAY10444.Il est de plus en plus reconnu que S1P, généré intracellulairement par SPK, peut être libéré dans l’espace extracellulaire et ainsi stimuler les récepteurs membranaires S1P, établissant une boucle autocrine (Kim et al., 2009; Takabe et al., 2010). Lorsque cela se produit, même un antagoniste spécifique du récepteur S1P peut inhiber la réponse à un agoniste autre que S1P. Les boucles autocrines pourraient expliquer le fait que JTE-013 et BML-241 inhibent les réponses à U46619, à l’endothéline-1 et à KCl élevé, et au récepteur P2 purinergique ou à la stimulation des récepteurs adrénergiques 1A-adrénergiques, respectivement. Cependant, les boucles autocrines ne peuvent pas expliquer pourquoi un agoniste tel que JTE-013 a une action chez les souris dépourvues de récepteurs S1P2. Les boucles autocrines S1P potentielles doivent être prises en compte lors du criblage des antagonistes des récepteurs S1P dans les systèmes complexes (niveau cellulaire ou organisme), en particulier lorsque les inhibiteurs SPK et le blocage des récepteurs S1P (pharmacologiquement ou prévenant l’expression des récepteurs) atténuent la réponse (Peter et al. 2008, Schnitzer et al., 2009, Salomone et al., 2010) .VPC23019 a été initialement décrit comme un antagoniste du récepteur S1P1 / 3, avec des valeurs de pKB de 7,5 et 6,0 pour les récepteurs S1P1 et S1P3, respectivement (Davis et al. 2005). Depuis lors, il a été principalement utilisé pour caractériser les réponses à médiation par le récepteur S1P1. Cependant, dans quelques études, il a également été utilisé comme antagoniste des récepteurs S1P3. Par exemple, comme mentionné ci-dessus, Lichte et al. (2008), ont rapporté que la signalisation du calcium induite par la S1P dans les kératinocytes humains est principalement médiée par S1P3, car elle peut être bloquée par les antagonistes S1P3 putatifs BML-241 et VPC23019. Récemment, Jongsma et al. (2009), en utilisant trois essais différents, ont montré que plusieurs composés de la série VPC, y compris VPC23019, se comportent comme des agonistes complets ou partiels sur les récepteurs S1P3.Bien que obtenus in vitro, dans un système exprimant une forte densité de récepteurs S1P3, ces données suggèrent que VPC23019 est un outil moins qu’idéal pour caractériser les réponses médiées par S1P3. Lors de l’étude des effets de S1P sur le tonus vasculaire, nous avons trouvé que VPC23019 potentialisait la réponse contractile induite par S1P dans les artères basilaires de rat et de souris avec endothélium intact, alors qu’elle ne le faisait pas dans les préparations sans endothélium (Salomone et al., 2008). Nous avons interprété cette découverte comme un résultat de l’antagonisme S1P1 exercé par VPC23019, car les récepteurs S1P1 situés sur l’endothélium vasculaire sont connus pour stimuler la libération d’oxyde nitrique et induire une vasodilatation (et peuvent donc contrer la vasoconstriction induite par les récepteurs S1P à S1P3). Cependant, nous avons été surpris de ne pas observer l’inhibition de la vasoconstriction induite par S1P par VPC23019, à des concentrations aussi élevées que M, lorsque des preuves solides (souris knock-out S1P3) ont indiqué que vasoconstriction induite par S1P a été médiée par S1P3 récepteurs En effet, Murakami et al. (2010) ont montré que le nouvel antagoniste de la S1P3, puissant et sélectif, TY-52156 restaure le flux sanguin coronaire réduit par S1P, mais VPC23019 était inactif dans ce système. Fait intéressant, la même étude a également montré que dans les cellules musculaires lisses coronaires isolées, TY-52156 inhibait à la fois l’activation de Rho et le signal Ca2 +, alors que VPC23019 inhibait seulement le signal Ca2 +. Pris ensemble avec nos données, cette étude suggère que les résultats obtenus avec VPC23019 doivent être interprétés avec prudence. Bien que nous soulignions dans cette perspective les questions liées à trois antagonistes de récepteurs particuliers, notre but est de faire un point méthodologique plus large sur la distinction entre sélectivité et spécificité. Le terme “ sélectivité ” devrait se référer à la capacité d’un médicament à discriminer entre des cibles apparentées (par exemple, des récepteurs ou des enzymes), montrant une affinité de liaison plus élevée pour un sous-type ou une isoforme. La sélectivité doit être évaluée par criblage dans des systèmes purs (par exemple des lignées cellulaires transfectées avec un sous-type de récepteur à la fois) et éventuellement dans des systèmes complexes, y compris des modèles de type sauvage in vivo et génétiquement modifiés. Le terme “ la spécificité ” devrait se référer non seulement à la capacité d’un médicament à identifier un récepteur d’intérêt, mais aussi à son potentiel de discrimination entre les interactions négatives et positives; c’est-à-dire que le médicament devrait lier le récepteur avec une affinité appropriée, le médicament devrait avoir une réactivité croisée faible / nulle avec d’autres récepteurs. Dans l’ordre pour “ spécificité ” Pour être évalué, le médicament doit donc être analysé pour son interaction avec la cible d’intérêt et pour son interaction avec autant de cibles biologiques non apparentées que possible. Pour les récepteurs, les études de liaison au ligand peuvent être considérées comme adéquates pour évaluer quantitativement l’affinité pour les sites de liaison examinés, mais nécessitent une évaluation plus approfondie de la fonction, en présence et en absence de l’agoniste de référence, pour classer un ligand donné comme agoniste ou antagoniste. À la fin des années 1980, les études pharmacologiques reposaient principalement sur l’utilisation d’agonistes et d’antagonistes (Salomone, 2010). Plus récemment, les chercheurs ont également manipulé les niveaux d’expression des récepteurs en utilisant des techniques moléculaires et des altérations génétiques. Cette approche représente, sous évaluation critique, la stratégie pharmacologique la plus spécifique disponible aujourd’hui. Lors de l’utilisation d’un médicament comme agoniste ou antagoniste, il faut considérer la probabilité d’effets hors cible; au lieu de cela, lorsqu’on utilise un animal knock-out de récepteur, on peut exclure, avec un grand degré de confiance, qu’un effet est médié par le produit récepteur du gène délété. Nous croyons donc qu’un tel contrôle génétique moléculaire, lorsqu’il est disponible, devrait être considéré comme la meilleure validation en pharmacologie analytique et expérimentale. Malheureusement, les agents pharmacologiques expérimentaux, agonistes ou antagonistes, sont de plus en plus utilisés pour arriver à des conclusions pharmacologiques sur la fonction du récepteur, même si les données sur leur sélectivité sont rarement suffisantes et peu d’informations sur leur spécificité sont disponibles. Comme le montre cette Perspective, ces conclusions sont parfois tirées malgré des preuves contradictoires (voir les lignes ombrées dans les Tableaux ​ Tableaux11 et ​ et2), 2), comme celles provenant des études de délétion des gènes. non utilisé chez l’homme (pour lequel une caractérisation pré-clinique étendue a découvert des actions hors cible potentielles) et pour lequel seules des informations limitées provenant de systèmes simples (in vitro, lignées cellulaires transfectées) sont disponibles doit être utilisée avec prudence et les données pharmacologiques obtenues doit être considéré comme une preuve faible, à moins d’être soutenu par des preuves plus solides et cohérentes (par exemple, des données génétiques knock-down ou knock-out, ou des preuves pharmacologiques concomitantes obtenues avec d’autres ligands chimiquement non apparentés).De plus, des données négatives et / ou contradictoires obtenues avec des ligands expérimentaux doivent être considérées et citées; en d’autres termes, des données négatives et / ou conflictuelles doivent être utilisées pour l’analyse rétrospective et pour interpréter les données déjà publiées avec ces composés. Enfin, les effets hors cible potentiels, y compris les effets non médiés par les récepteurs, doivent toujours être pris en compte et peuvent parfois être soupçonnés en examinant la réversibilité (de nombreux effets induits par les récepteurs sont réversibles, les effets toxiques non spécifiques sont souvent irréversibles), la concentration et # x02013; réponse ou dose – relation de réponse, ou à la cinétique de la réponse (certains effets sont trop lents ou trop rapides pour être compatibles avec une fonction réceptrice donnée)