"Dan Ferro has taught some of the most
important singers of the 20th Century"
Brian Zeger - The Juilliard School
The Metropolitan Opera

"Intensive study of vocal technique as applied to the literature for active singers"

Les enquêtes génomiques démasquent Mycoplasma amphoriforme, un nouvel agent pathogène respiratoire

Contexte Mycoplasma amphoriforme a été associé à une infection chez des patients présentant une déficience en anticorps primaires PAD On connaît peu l’histoire naturelle de l’infection par cet organisme et sa capacité à se transmettre dans la communauté. Méthodologie La charge bactérienne a été estimée par des échantillons séquentiels de polymérase quantitative Réaction en chaîne Les génomes de tous les isolats disponibles, provenant de patients au Royaume-Uni, en France et en Tunisie, ont été séquencés avec la souche type. Les données génomiques ont été assemblées et annotées, et un arbre phylogénétique à haute résolution a été construit. données de séquençage du génome entier, nous montrons que les patients peuvent être chroniquement infectés avec M amphoriforme se manifestant comme une charge bactérienne rémittente, entrecoupée par des périodes où l’organisme est indétectable Important, nous démontrons la transmission des souches dans un environnement clinique Les mutations de résistance aux antibiotiques s’accumulent dans Les isolats de Mycoplasma amphoriforme forment une espèce étroitement apparentée responsable d’une infection chronique récurrente et rémittente chez des patients atteints de MAP au Royaume-Uni et chez des patients immunocompétents dans d’autres pays. Nous fournissons des preuves solides de transmission entre les patients du même clinique, ce qui suggère que le dépistage et l’isolement peuvent être nécessaires pour les patients sensibles Ce travail démontre le rôle critique que WGS peut jouer dans le dénouement rapide de la biologie d’un nouvel agent pathogène

Mycoplasma amphoriforme, séquençage du génome entier, infection respiratoire, contrôle des infections, déficit en anticorps primairesInfection des voies respiratoires inférieures Le LRTI est une cause importante de morbidité et de mortalité dans tous les groupes d’âge, en particulier chez les patients immunodéprimés. [Mycoplasma amphoriforme a été isolé pour la première fois chez un patient atteint d’agammaglobulinémie liée à l’X et de bronchite chronique. Le patient expectorait un volume important d’expectorations négatives pour tous les autres pathogènes des voies respiratoires inférieures reconnus. Le MAM amphoriforme M Basé sur le séquençage du gène de l’ARN ribosomique de l’ARN ribosomique, l’espèce la plus proche est Mycoplasma testudinis La MAM se développe mal sur les milieux mycoplasmes standard et manque l’apparence des autres espèces de Mycoplasma. isolé dans le monde entier, et la majorité des iso Les patients traités par PAD dans une seule clinique spécialisée à Londres, avec des isolats supplémentaires provenant de patients immunocompétents au Danemark, en France et en Tunisie ont examiné la charge de morbidité liée aux infections respiratoires profondes sur la santé humaine et l’association récente du MAM avec le LRTI. chez les patients immunocompétents , il est important de comprendre la dynamique de l’infection chronique avec cet organisme et de déterminer s’il est transmis chez les patients vulnérables et comment ces souches se rapportent à d’autres souches isolées. séquençage WGS, nous fournissons des preuves pour de multiples souches circulant à l’échelle internationale, l’infection respiratoire chronique récurrente, et, surtout, la transmission de patient à patient dans un environnement hospitalier

Méthodes

Patients, échantillons et approbation éthique

Le comité d’éthique de la RFL a approuvé ces études. Des échantillons d’expectoration ont été prélevés chez un total de patients adultes atteints de PAD fréquentant la PAD Clinic à la RFL et testés pour MAM en utilisant la culture Mycoplasma, un gène S ARNr MAM-. réaction en chaîne de la polymérase PCR S PCR, et une uracile ADN glycosylase PCR quantitative spécifique MAM udg polymérase quantitative en chaîne [qPCR] Un total d’isolats séquentiels des patients MAM positifs étaient disponibles pour WGS En outre, trois patients de trois patients ont rapporté précédemment fourni par l’Université de Bordeaux Tableau supplémentaire L’information clinique a été examinée pour la preuve des symptômes associés au LRTI

Extraction d’ADN

L’ADN de WGS a été extrait en utilisant le kit d’extraction d’ADN génomique Wizard Promega, Southampton, Royaume-Uni, suivant les instructions du fabricant en utilisant le protocole pour les bactéries Gram négatif, et amplifié en utilisant l’illustra Genomiphi Vkit GE Healthcare, selon les instructions du fabricant

PCR spécifique au MAM

La PCR S conventionnelle spécifique à la MAM a été réalisée de manière prospective, et le qPCR ciblant l’udg en temps réel a été réalisé rétrospectivement sur des extraits d’ADN provenant d’échantillons de patients atteints de MAP, comme décrit précédemment .

WGS: Génome de référence

Le génome de la souche MAM de référence A a été séquencé à une profondeur de couverture en utilisant le vecteur de clonage pTWI avec une sélection de tailles d’inserts – kb, – kb et – kb en utilisant la chimie de terminaison de colorant sur les séquenceurs ABI Life Technologies Ltd, Paisley, UK Des régions répétitives du génome ont été étalonnées et l’assemblage a été finalisé à l’aide d’une PCR à longue portée et d’une paire d’informations. Le génome a été annoté comme décrit précédemment, en utilisant Artemis Le génome a été séquencé. La séquence d’ADN génomique a été comparée à la base de données procaryotes EMBL du laboratoire européen de biologie moléculaire utilisant BLASTN et BLASTX Les ARN de transfert ont été prédits par tRNAscan-SE Les séquences codantes potentielles ont été prédites avec GLIMMER et les résultats ont été vérifiés manuellement. les séquences ont été recherchées dans une base de données de protéines non redondantes à l’aide de WUBLASTP et de FASTA. La traduction complète de l’image a été utilisée pour rechercher h PROSITE , et les protéines prédites ont été comparées à la base de données Pfam du domaine protéinique en utilisant des modèles de Markov cachés et l’outil de recherche de domaine conservée contre la base de données de domaines conservés du Centre national d’information sur la biotechnologie. compilé en utilisant Artemis et utilisé pour une annotation manuelle gène par gène de la séquence et des protéines prédites. L’annotation était basée, si possible, sur des protéines ou des gènes caractérisés. Les séquences répétées étaient identifiées à l’aide du programme Dotter et manuellement

WGS: Isolats cliniques

WGS a été réalisée sur des isolats simples sur un instrument MiSeq Illumina, San Diego, Californie Une version du kit de réactifs MiSeq Acycle a été utilisée pour générer des lectures appariées bp -bp Les lectures obtenues pour chaque isolat ont été cartographiées avec la souche de référence MAM A avec SMALT à: http: // wwwsangeracuk / resources / software / smalt / Polymorphismes mononucléotidiques Les SNP ont été identifiés en utilisant SamTools Mpileup et bcftools, et filtrés comme décrit précédemment

Numéros d’accession

Les données de séquences brutes sont disponibles sous le numéro d’accès ERP. La séquence et l’annotation pour MAM A ont été déposées avec le numéro d’accession EMBL HG.

Analyse phylogénétique

Les régions à haute densité de SNP ou SNP dans les régions répétitives ont été exclues de l’analyse phylogénétique comme décrit précédemment. Les arbres phylogénétiques à maximum de vraisemblance ont été construits avec un maximum de vraisemblance aléatoire et aléatoire en utilisant un modèle évolutif réversible généralisé et une correction γ pour le taux variation La prise en charge des relations dans l’arbre phylogénétique à maximum de vraisemblance a été évaluée en exécutant des répétitions bootstrap

Détection des variantes minoritaires

Des variantes minoritaires ont été extraites des données de cartographie en utilisant des filtres rigoureux pour distinguer les vraies variantes des erreurs de séquençage ou de cartographie. Une variante n’a été comptée que si confirmée par au moins des lectures avec au moins des lectures sur chaque brin. Variantes requises: biais de brin P valeur d’au moins, profondeur de couverture dans une plage normale ±% de la moyenne et distance d’au moins bp d’une autre variante Comme la profondeur de couverture varie à travers le génome, nous avons corrigé chaque compte en divisant par la profondeur Par exemple, pour une position particulière avec une profondeur de couverture des lectures, nous avons enregistré Nous avons additionné ces valeurs pour produire un score variant minoritaire pour chaque échantillon, avec des scores plus élevés indiquant une plus grande diversité dans l’échantillon

RÉSULTATS

Patients, échantillons longitudinaux et charge bactérienne

Tous les patients présentaient des signes de toux productive chronique et certains présentaient des volumes d’expectoration élevés. La durée de collecte des échantillons variait entre des années et le nombre d’épisodes récurrents de LRTI associés à la MAM variant entre des épisodes pour lesquels des données cliniques sont disponibles. Parmi les échantillons prélevés en série disponibles pour les examens de laboratoire des patients, on a trouvé que la moitié des patients présentaient des signes de maladie obstructive des voies respiratoires, de% étaient positifs à la MAM par culture, de % étaient positifs pour qPCR Aucun autre pathogène bactérien reconnu par LRTI n’a été identifié dans les échantillons pour lesquels des résultats de culture d’expectoration étaient disponibles. Parmi les échantillons positifs pour MAM où un autre pathogène LRTI a été cultivé, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae et Moraxella catarrhalis Un résumé des résultats pour tous les échantillons MAM-positifs est donné Tableau supplémentaire

Figure Vue largeDownload slideHistoire naturelle d’un patient atteint d’une infection à Mycoplasma amphoriforme Les unités formatrices de colonie sont estimées à l’aide de la réaction en chaîne de polymérase quantitative udg PCR Les symboles représentent les bactéries isolées et le traitement antibiotique utilisé * udg PCR n’a pas été effectuée. par culture ou ARN ribosomal S PCR Abréviations: AMX, amoxicilline; AZM, azithromycine; CM, clarithromycine; RCR, ciprofloxacine; DOX, doxycycline; H Inf, Haemophilus influenzae; M Catt, M ​​cattarhalisFigure View largeTableau de téléchargementHistoire naturelle d’un patient atteint d’une infection à Mycoplasma amphoriforme Les unités formant des colonies sont estimées à l’aide de la réaction en chaîne de polymérase quantitative udg PCR Les symboles représentent les bactéries isolées et le traitement antibiotique utilisé. le patient était positif par culture ou ARN ribosomique S PCR Abréviations: AMX, amoxicilline; AZM, azithromycine; CM, clarithromycine; RCR, ciprofloxacine; DOX, doxycycline; H Inf, Haemophilus influenzae; M Catt, M ​​cattarhalisLes données de charge bactérienne obtenues par qPCR indiquent une infection prolongée Figure et Figure supplémentaire Nous utilisons le patient, dont l’isolat original et maintenant la souche type, A, a été isolée , comme exemple du cours observé de l’infection. connu un cours chronique d’expectorations purulentes ou mucopurulentes productives pour & gt; années avec une charge bactérienne MAM constamment élevée. Figure Parmi les échantillons prélevés entre et à partir de la figure du patient, la MAM a été détectée par PCR à toutes les occasions sauf; Les seuls autres pathogènes bactériens reconnus identifiés dans les échantillons MAM-positifs de ce patient étaient M catarrhalis et H influenzae Figure Patient a également suivi une évolution chronique, avec évidence de une toux productive à toutes les visites au cours des années avec des expectorations purulentes ou mucopurulentes Les échantillons étaient positifs à la culture MAM à des occasions et tous ceux testés par PCR étaient positifs, avec seulement un seul isolement de S pneumoniae pendant cette période

Séquences génomiques d’isolats cliniques

Le WGS a l’avantage de fournir les données de résolution les plus élevées possibles pour différencier les isolats étroitement apparentés. Le génome A est Mb avec une teneur en GC% De plus, des séquences de génomes entiers utilisant MiSeq ont été déterminées pour les isolats MAM cultivés, cet ensemble étant limité par des isolats qui n’ont pas réussi à reculturerEn appelant les SNP contre notre séquence de référence de haute qualité, nous avons construit un arbre phylogénétique de vraisemblance maximale en tenant compte de la recombinaison possible en utilisant la méthode de Croucher et al . La figure montre que les isolats de MAM séquencés tombent dans les clades principaux: représentés par des isolats britanniques prélevés sur des patients participant à la RFL et un cinquième contenant un seul isolat. En outre, les souches françaises, tunisiennes et britanniques étaient très diverses. nd n’étaient pas inclus dans cette analyse phylogénétique Figure et figure supplémentaire Le niveau global de variation basée sur les séquences est faible, avec des distances entre les clades allant des SNP, et un maximum de SNP minimum = séparer toute paire d’isolats au sein du clade. les isolats britanniques de la RFL sont plus semblables les uns aux autres que les souches françaises de l’ex-groupe Les isolats d’un individu sont plus proches les uns des autres que ceux des autres patients Où nous avons plusieurs échantillons longitudinaux prélevés chez un seul patient , la phylogénie ne semble pas être entièrement compatible avec les dates de collecte des échantillons Certains isolats qui semblent plus basaux dans l’arbre ont été collectés plus récemment. Figures et A, Dans l’ensemble des souches, nous avons détecté des variantes minoritaires, et chez les patients il y avait une tendance vers l’augmentation du nombre de variantes minoritaires au fil du temps Figure B

Figure Vue largeDisque de téléchargement Arbre de phylogénétique à maximum de vraisemblance pour des isolats de Mycoplasma amphoriforme provenant de patients distingués par la couleur et la souche désignée par son code de Royal Free London National Health Service Trust et des isolats français / tunisiens Le tableau a été construit avec un maximum de vraisemblance aléatoire. Modèle évolutif réversible à temps généralisé et correction γ pour la variation du taux entre sites Les polymorphismes mononucléotidiques SNP sont notés pour l’ARN ribosomique S, et les SNP non synonymes pour les gènes gyrA, gyrB et parC utilisant la numérotation amphoriforme M Pour chacun, un rouge ou barre rose saumonée indique une association du SNP avec une résistance phénotypique aux antibiotiques, rose une association possible, et bleu représente l’allèle ancestral sensible. Les valeurs de support de Bootstrap pour les relations montrées dans la phylogénie peuvent être trouvées dans la Figure supplémentaire. arbre phylogénétique pour est des oléates de Mycoplasma amphoriforme de patients distingués par la couleur et la souche désignée par son code de Royal Free London National Health Service Foundation Trust et d’isolats franco-tunisiens Le tableau a été construit avec un maximum de vraisemblance aléatoire randomisée en utilisant un modèle évolutif -correction pour la variation du taux entre sites. SNP polymorphismes mononucléotidiques SNP sont notés pour l’ARN ribosomique S et SNP non synonymes pour les gènes gyrA, gyrB et parC en utilisant la numérotation amphoriforme M Pour chacun, une barre rouge ou rose saumon indique une association du SNP avec résistance phénotypique aux antibiotiques, rose une association possible, et le bleu représente l’allèle ancestral, l’allèle sensible Les valeurs de support de Bootstrap pour les relations montrées dans la phylogénie peuvent être trouvées dans la Figure supplémentaire

Figure Vue largeDownload slideA, Accumulation de polymorphismes mononucléotidiques Les SNP détectés dans les isolats de Mycoplasma amphoriforme disponibles chez les patients orange et vert ou bleu de Numbers indiquent le nombre de SNP que les isolats ont comparé à la séquence de souche de type A, également isolée du patient B, Mesure de la diversité des isolats cliniques détectés à différents moments d’échantillonnage pour le patient Les nombres représentent les nombres de variantes minoritaires détectées, corrigées pour la profondeur de couverture Les variantes minoritaires ont été comptées si elles étaient supportées par au moins lectures, sur chaque brin et base et la qualité de la cartographie de et, respectivement Il existe une tendance non significative positive entre le temps et le nombre de variantes minoritaires, indiquant une augmentation de la diversité au cours de l’infection modèle de régression linéaire: r =, P = Figure View largeTélécharger slideA, Accumulation of single- SNP de polymorphismes nucléotidiques détectés dans l’isolat de Mycoplasma amphoriforme disponible Les chiffres indiquent le nombre de SNP que les isolats ont comparé à la séquence de souche de type A, qui a également été isolée chez le patient B. Mesure de la diversité des isolats cliniques détectée à différents moments d’échantillonnage pour le patient Les chiffres représentent le nombre de variantes minoritaires détectées, corrigées pour la profondeur de couverture Les variantes minoritaires ont été comptées si elles étaient supportées par au moins des lectures, avec des lectures sur chaque brin et une qualité de base et de cartographie de et, respectivement. de variantes minoritaires, indiquant une augmentation de la diversité au cours de l’infection modèle de régression linéaire: r =, P =

Infection croisée et évolution

Figure: patient présenté deux fois avec des isolats presque identiques de la même lignée entre et; Les analyses comparatives SNP des isolats MAM du patient indiquent un événement de transmission probable. Le premier isolat séquencé du patient IM-; Figure recueillie dans les chutes dans le clade, mais est distincte des autres membres de ce clade qui est, une souche distincte Les séquences des isolats ultérieurs O- et – recueillis dans et tomber dans la diversité des isolats du patient Figures et A La collection les dates des spécimens indiquent que le patient et le patient ont fréquenté la clinique externe le même jour à l’occasion. Les isolats provenant des patients ont partagé des SNP ≥ avec le dernier isolat du patient; le plus grand nombre de SNP partagés entre les isolats de ces patients se trouve au début, ce qui suggère une transmission vers cette date. Figure A

Résistance aux antibiotiques

D’après l’analyse de séquence, il n’y a eu aucune acquisition de gènes entiers au cours de l’une des infections au PAD au Royaume-Uni, ne fournissant aucune preuve d’acquisition de résistance par transfert de gène horizontal, p.ex. tetM Un total de SNP a été identifié dans tous les isolats de gyrA. Parmi les SNP détectés dans gyrB, il y avait des changements d’acides aminés non-synonymes aux positions VI, PQ et VA Un total de SNPs non-synonymes ont été identifiés dans le gène parC, en position de position. Les isolats de France et de Tunisie présentaient un résidu sérine à la position associée à un phénotype sensible, alors que tous les isolats britanniques, y compris l’isolat de référence A, présentaient des substitutions F ou Y, ce qui implique que les isolats du R.-U. étaient résistants aux quinolones Un total de mutations ont été détectées dans le gène de l’ARN ribosomique, dont le gène était situé dans une région précédemment associée au macr résistance aux olides Deux souches de patients isolées dans les deux cas portent une substitution AG dans les derniers isolats de cette série. Les tests de sensibilité in vitro de cet isolat ont montré que cette souche avait une concentration inhibitrice minimale de μg / L et μg / L pour la doxycycline et la ciprofloxacine, respectivement

DISCUSSION

en l’absence d’autres agents pathogènes respiratoires reconnus et la présence continue de symptômes, il suggère que la MAM provoque une inflammation bronchique. Une évolution récurrente similaire est observée chez les patients immunocompétents atteints de maladie pulmonaire obstructive chronique où la charge bactérienne est plus élevé pendant l’exacerbation que pendant l’état stable Le contrôle de la charge bactérienne est associé à un risque réduit de rechute Les expectorations purulentes persistantes et la maladie obstructive des voies respiratoires suggèrent une inflammation continue des voies respiratoires en association avec MAM Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour élucider la relation entre cet organisme et changement de la fonction respiratoire Une tendance à l’augmentation des variantes minoritaires chez une personne chroniquement infectée qui n’a pas atteint de signification statistique peut suggérer que les organismes existent comme un mélange de plus en plus hétérogène dans l’infection chronique. Ce résultat doit être traité avec prudence. un m En outre, nous ne savons pas combien de variantes ont pu être générées ou sélectionnées pour la croissance in vitro de ces échantillons. Le nombre limité d’échantillons et la profondeur d’échantillonnage sont insuffisants pour capturer toute la diversité. Cependant, cette observation est cohérente avec les études des infections chroniques et explique la relation complexe entre la phylogénie et la date de l’isolement. Dans une épidémie de S aureus dans une unité de soins néonataux, la souche porté par un membre du personnel a différé jusqu’à SNP lorsque différentes colonies d’un échantillon ont été séquencés indépendamment , et est compatible avec la mauvaise corrélation entre la date d’isolement et la parenté phylogénétique des échantillons en série de patients montrés iciPatients avec des déficits anatomiques ou génétiques ou immunocompromis sensibles à l’infection croisée dans l’environnement hospitalier et les pathogènes respiratoires dans un setti clinique Mycobacterium tuberculosis chez les patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine et Burkholderia cepacia chez les patients atteints de mucoviscidose Comme la plupart des souches M amphoriformes ont été isolées dans un seul hôpital, il est possible que cela représente une épidémie nosocomiale non reconnue. répondre à cette question sans équivoque Presque tous les patients étudiés dans cette collection avaient une souche génétiquement distincte dans leurs poumons, ce qui exclut la possibilité d’une flambée épidémique ponctuelle. L’interaction entre les patients est significative, car ces patients étaient à la clinique sur le La souche isolée du patient est distincte des souches isolées dans et, et les dernières souches sont suffisamment similaires à la souche du patient pour indiquer que la transmission s’est produite. La carte de l’accumulation de SNP pour le patient Figure A suggère que la transmission était associée à des visites à Il est à noter que tous sauf les isolats de patients PAD britanniques et de France et de Tunisie, bien que distincts, sont étroitement apparentés. Les autres isolats sont plus diversifiés mais font partie de la même espèce. Des souches plus fortement divergentes peuvent former des lignées distinctes. Les patients atteints de MAPP ont reçu plusieurs traitements antibiotiques et ont reçu des immunoglobulines régulièrement. La modification de la charge bactérienne peut être liée au traitement, mais l’enregistrement incomplet rend la relation entre le traitement et la charge bactérienne incertaine Nous avons détecté des mutations de résistance dans la QRDR de la parC de tous les isolats du Royaume-Uni, indiquant que ces souches sont susceptibles d’être résistantes. a été traité avec des cours d’antibiotiques, y compris nolones, sans amélioration et qui a seulement répondu à l’agent pleuromutiline valnémuline Econor La substitution du résidu sérine à la position de la QRDR par la numération E coli est connue pour conférer une résistance aux quinolones dans M hominis Les mutations associées à la résistance macrolide étaient également détecté chez les patients atteints de MAP; En résumé, nous avons utilisé la génomique pour différencier entre la persistance et la réinfection, apportant la preuve que M amphoriforme infecte les patients immunocompétents et immunodéprimés , est chronique chez les patients présentant une mutation du hotspot. patients atteints de MAP et est associée à une maladie obstructive des voies respiratoires La transmission peut survenir dans un environnement clinique, suggérant que des précautions respiratoires peuvent être nécessaires L’utilisation du séquençage de nouvelle génération nous a permis d’améliorer notre compréhension de la biologie et de l’épidémiologie plus rapidement. par des méthodes de génotypage phénotypiques ou autres

Données supplémentaires

Les documents supplémentaires sont disponibles à Clinical Infectious Diseases en ligne http: // cidoxfordjournalsorg Les documents supplémentaires sont constitués de données fournies par l’auteur qui sont publiées au profit du lecteur Les documents affichés ne sont pas copiés Le contenu de toutes les données supplémentaires sont de la seule responsabilité des auteurs ou les messages concernant les erreurs doivent être adressés à l’auteur

Remarques

Soutien financier Le Wellcome Trust [subventions et / Z // B à JMB, SRH, HMB SS, NRT], le numéro de subvention du Medical Research Council G [à JMB], les fiduciaires spéciaux du Royal Free London, National Health Service Foundation Trust SHG, T Mc H, CL, et l’Université de St Andrews Medical School SHG, K OPotentiel conflits d’intérêts Tous les auteurs: Aucun conflit d’intérêt potentielTous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits potentiels Conflits d’intérêts que les éditeurs considèrent pertinents au contenu du manuscrit ont été divulgués