"Dan Ferro has taught some of the most
important singers of the 20th Century"
Brian Zeger - The Juilliard School
The Metropolitan Opera

"Intensive study of vocal technique as applied to the literature for active singers"

Grande diversité des types d’EM de streptocoques du groupe A dans une communauté indienne: nécessité d’adapter les vaccins multivalents

Contexte L’émergence de souches résistantes aux antibiotiques et la morbidité et / ou la mortalité liées au rhumatisme articulaire aigu et à la cardiopathie rhumatismale ont été un stimulant continu pour le développement d’un vaccin sûr et efficace contre le streptocoque du groupe A à ce jour, & gt; En général, l’immunoglobuline G sérique dirigée vers la portion NH hypervariable de la protéine M entraîne la fixation du complément et l’opsonophagocytose du sérotype streptococcique homologue par des leucocytes polymorphonucléaires, et la protection est spécifique au type. En raison de l’hypervariabilité dans ces séquences opsoniques de différents types M, il était pertinent d’utiliser des épitopes dérivés de ces multiples séquences dans un modèle de “vaccin multivalent” pour l’évaluation de la protection contre ces types M. Dans cette étude, nous avons effectué pour la première fois, à notre connaissance, la caractérisation moléculaire d’isolats prélevés chez des patients du nord de l’Inde. -En essayant d’étudier les types M circulants et leur variabilité de la séquence N-terminale. Résultats Nous rapportons la grande diversité des souches de SAG récupérées chez les patients symptomatiques, avec des implications sur la conception des vaccins appropriés. Cinquante-neuf isolats représentaient différents types de séquences. Très peu de types nouveaux et aucun clone prédominant. rencontrés en une seule année suggère que tout vaccin multivalent à base de protéines M devrait être spécifiquement adapté à cette région

L’infection à GAS est également associée à des maladies invasives et non invasives, ainsi qu’aux séquelles post-infectieuses potentiellement fatales, à la fièvre rhumatismale, aux cardiopathies rhumatismales et à la glomérulonéphrite post-streptococcique aiguë. Historiquement, le GAS a été sous-classé sur la base de la diversité sérotypique de la protéine M, facteur majeur de virulence GAS. Le haut degré de variabilité à l’extrémité amino de la protéine M explique la diversité sérotypique observée, avec en général des anticorps. élevé contre les extrémités amino d’un type M de GAS étant non réactif avec les extrémités amino d’autres types M Actuellement, & gt; M types ont été décrits Le séquençage de l’ADN du gène emm codant pour la protéine M est en train de devenir la méthode de choix pour discriminer les types M Il existe une excellente corrélation entre le type de séquence emm et le type M Souches GAS typables M Beaucoup de ces nouveaux types d’emm ont été isolés dans des pays en voie de développement présentant des niveaux élevés d’infection streptococcique et des taux élevés de rhumatisme articulaire aigu et de cardiopathie rhumatismale. Nombre de vaccins candidats basés sur l’extrémité amino de la protéine M sont en cours de développement L’extrémité amino de la protéine M est hautement immunogène et les anticorps dirigés contre cette région sont opsoniques et corrélés à la protection. Cependant, comme les anticorps de cette région ne protègent que contre les souches homologues, des epitopes pour assurer une large couverture de couverture Etant donné le grand nombre de types de séquences M ou emm, il semblerait irréalisable o Inclure tous les types M dans un seul vaccin La connaissance des types d’EM circulants est donc importante dans la conception du vaccin régional GAS La fièvre rhumatismale est la cause la plus fréquente de cardiopathie chez les enfants et les jeunes adultes en Inde L’incidence déclarée des cardiopathies rhumatismales est aussi élevée comme les cas par enfant, ce qui représente environ les deux tiers de toutes les admissions à l’hôpital pour des événements cardiologiques dans le pays Compte tenu de la taille de la population indienne, le rhumatisme articulaire aigu et les cardiopathies rhumatismales représentent une part significative des cas Bien que de nombreuses études aient examiné la charge streptococcique dans divers endroits en Inde, et bien que d’autres aient examiné des données relatives à la cardiopathie rhumatismale, aucune étude n’a examiné l’épidémiologie moléculaire des types d’emm dans la population indienne. important pour prédire d’éventuelles épidémies et pour la conception rationnelle de M vaccins régionaux amino-terminaux protéiques Cette étude a entrepris une étude des types de GAS emm associée à une pharyngite prélevée dans un hôpital de Chandigarh, dans le nord de l’Inde. Nos résultats indiquent que, dans cette communauté, il y avait un nombre élevé de types circ emm. La production d’un vaccin candidat basé sur les terminaisons amino présentes semble donc irréalisable pour cette population vulnérable. Contrairement à d’autres études de régions en développement, aucun nouveau type d’emm ne s’est produit. Cependant, plusieurs types d’emm ne sont décrits qu’en Asie du Sud-Est. un biais géographique possible dans la distribution de certains types d’emm

Méthodes

Collecte et isolement d’isolats Des échantillons d’écouvillonnage ont été prélevés chez chacun des enfants âgés de plus de 5 ans présentant des symptômes de pharyngite streptococcique, p. Ex. Mal de gorge / pharyngite, érythème du pharynx et amygdales / lymphadénopathie Mars à février Des échantillons de prélèvements de gorge ont été cultivés sur des plaques de gélose au sang% -% de sang de mouton défibriné et incubés à ° C pendant – h en présence de% CO des échantillons reçus, β-hémolytiques et ~% positifs au GAS, comme testé par la sensibilité à l’U de bacitracine et par des résultats positifs pour l’agglutination avec des antisérums spécifiques du groupe A par le test d’agglutination au latex Streptex Kit; En résumé, des cultures bactériennes d’une nuit dans un bouillon Todd-Hewitt contenant% de néopeptone ont été centrifugées, et un ul du surnageant a été mélangé avec des ul de sérum de cheval dans une plaque de microtitrage. Les plaques ont été incubées à ° C pendant une nuit dans une chambre humide. Le jour suivant, μL de solution saline a été mélangé avec le contenu de chaque puits et marqué pour l’opalescencevir Typing ont été soumis à un typage vir selon une méthode décrite ailleurs. Cette méthode implique l’amplification du régulon mga, y compris l’emm et d’autres gènes emm-like et la digestion avec les endonucléases de restriction HaeIII ou HinfI Le modèle résultant visualisé sur un gel d’agarose est unique pour une souche spécifique et a été corrélé avec M type Les amorces utilisées pour la PCR vir étaient VUF ‘-AAACCGTATCTTTGACGCACTCGAGGACAATTTGCGAGATTAG-‘ et SBR ‘-AGACATGAGCTCAATGGCAAGTTTATCAAAT Les conditions d’amplification étaient: ° C pour min, puis ° C pour s, ° C pour min, et ° C pour min pour les cycles. Les produits de PCR ont été digérés avec U de HaeIII ou HinfI et soumis à électrophorèse dans un gel d’agarose%, PCR, L’ADN chromosomique a été extrait du GAS en utilisant le DNAeasy Tissue Kit Qiagen Une seule amorce directe S LEAD [‘-CAGTATTCGCTTAGAAAATTAAAA-‘] située dans l’ADN codant pour la séquence leader de la protéine M a été utilisée pour la PCR impliquant des gènes emm du facteur d’opacité OF Souches-positives et négatives-négatives Différentes amorces inverses ont été utilisées pour la PCR impliquant des gènes emm de souches OF-négatives S MEMB [‘-CCCTTACGGCTTGCTTGCTTCTGA-‘] et des souches OF-positives S SPEC [‘-CAGTGCTGATCTTGAACGGTTAGC-‘] ou S ENN [‘ -CAGTGCAGATACCATCACTGTTGCA- ‘] Les conditions de cyclage PCR étaient les suivantes: dénaturation à ° C pendant 5 s, hybridation à ° C pendant s et extension à ° C pendant min pour les cycles. Les produits de PCR ont été soumis à électrophorèse sur un gel d’agarose en Les produits PCR Qiagen ont été séquencés en utilisant le kit de réaction ABI Dye Terminator Cycle Sequencing Ready sur un séquenceur automatique ABI Applied Biosystems Des séquences d’ADN contiguës ont été assemblées en utilisant le paquet Staden http: // wwwncbinlmnihgov, et la séquence de signal prédite et le début de protéines matures ont été déterminées BLAST `n ‘recherches http: // wwwncbinlmnihgov / blast / blastcgi sur les premiers nucléotides correspondant au début des protéines M matures prédites ont été utilisés pour identifier des séquences dans la base de données GenBank similaire aux séquences de requête Une séquence de requête était considéré comme représentant un type emm si il était ⩾% identique à une séquence type emm dans la base de données GenBank analyse ADN RAPD polymorphe amplifiée RAPD analyse a été réalisée pour résoudre l’identité des isolats GAS avec des types M similaires mais des profils de type vir variables Les amorces P ‘-GATCAAGTCC-‘ et P ‘-GATATGACAC-‘ ont déjà été utilisés pour l’analyse RAPD de G Chromosomes AS Les conditions de PCR étaient ° C pendant min; suivi de ° C pour s, ° C pour min, et ° C pour min, pour les cycles; et ° C pour s, ° C pour s, et ° C pour s, pour les cycles

Résultats

Trente-trois pour cent des isolats étaient positifs. Le gène emm a été amplifié à partir de chacun des isolats, et le type emm avec l’homologie la plus proche des isolats identifiés dans cette étude est listés dans le tableau Les isolats examinés représentent différents types de séquences Quarante-quatre des souches examinées étaient des types emm de référence ou un allèle de type emm et représentaient différents types emm ou emmL Six isolats étaient identiques à emm, identiques à emm et identiques à emm à leur extrémité amino-terminale; les types emm,,,,,,, et de séquence étaient représentés deux fois. Deux souches examinées étaient identiques aux gènes emm trouvés dans les isolats streptococciques du groupe G. Une analyse plus poussée de ces souches par l’agglutination au latex Les isolats restants étaient identiques ou similaires à des types de séquences typables non-M. Les plus communs étaient NS et sp / VT, qui ont été identifiés au moins deux fois. Un nouveau type de séquence provisoire a été identifié. “StI” a été identifié La comparaison avec d’autres gènes emm a indiqué que ce nouveau type d’emm est similaire au gène emmL avec les insertions d’un segment bp et -bp de la paire de bases à la région amino-terminale, qui aboutit à proline-alanine-alanine- Insertions de glycine et de tyrosine-asparagine-alanine dans la figure de séquence d’acides aminés Certains des isolats ont présenté une homologie de>% avec certaines étiquettes de séquence, comme TP-c, AAB et AAD, qui ont été récupérés en Thaïlande et en Inde, par exemple, suggérant un possible biais géographique dans leur isolement

Tableau View largeDownload slideDistribution des types d’emm chez les isolats indiens de streptocoques du groupe ATable View largeTélécharger une diapositiveDistribution des types d’emm chez des isolats indiens de streptocoques du groupe A

Figure Vue largeTélécharger la diapositiveA, Alignement des aminoacides de l’isolat indien I et M La séquence I contient des insertions bp et -bp de la paire -base, comparées à la référence M, entraînant les insertions d’acides aminés observées Un certain nombre d’autres substitutions d’acides aminés sont également évidentes B, Alignement de M et de l’isolat indien JV-JV- contient des deletions d’acides aminés X et XFigure Vue largeTélécharger la diapositiveA, Alignement des acides aminés de l’isolat indien I et M La séquence I contient des insertions bp et -bp de la paire de bases, comparées à la référence M , résultant des insertions d’acides aminés observés Un certain nombre d’autres substitutions d’acides aminés sont également évidentes B, Alignement de M et isolat indien JV-JV- contient des délétions d’acides aminés X et XHomology aux types emm existants a été définie en examinant la région amino-terminale de gènes emm, parce que cette région confère une identité sérotypique à chaque souche GAS L’analyse des séquences de gènes complets a montré que, bien que les extrémités amino peuvent être identiques, les différences de séquence surviennent toujours en aval Cinq isolats sont identiques à emm à leur extrémité amino, et tous démontrent% identité les uns aux autres tout au long des répétitions B et C du gène emm Cependant, ils contenaient des différences significatives par rapport à la région C-terminal de la souche des isolats identifiés comme contenant le type de séquence NS contenaient également une insertion supplémentaire de -bp Un des isolats JV comparé à emm; figure trouvé identique à emm à son extrémité amino présentait également un grand degré de divergence Un autre de ceux-ci contenait de grandes Ces différences indiquent que, même si le type de séquence emm peut être similaire, la diversité génotypique au sein des types emm est encore observable Pour tester davantage la clonalité des multiples isolats d’un type emm, nous avons effectué vir typingvir Typing a été effectuée sur des isolats utilisés dans cette étude Nous avons constaté que cette méthode était capable de faire la distinction entre les différents emm types figure Un des isolats de type emm avait un profil vir différent De même, des isolats correspondant au type emm avaient aussi un profil différent des autres isolats de type emm. L’analyse RAPD effectuée sur chacune de ces souches a confirmé que les souches avec un type différent type vir avait aussi un profil RAPD différent

Les profils types des isolats de streptocoques indiens du groupe A de différents types d’emm démontrent la corrélation entre ces méthodes de typage cristallisation. Les différences dans les types de vir viraux pour les isolats individuels des types emm et emm Les types vir représentés correspondent aux types emm: voies -, M; voies -, M; voie, M; voie, M; voie, M; voie, sp / VT; voie, NS; voie, M; voie, AAL; voie, M; voie, M; voie, M; voie, M; voie, stI; voie, M; GV LGFigure Voir en grandDownload slidevir Profils de types d’isolats de streptocoques du groupe A indiens de différents types d’emm montrant la corrélation entre ces méthodes de typage Des différences sont également observées dans les types de virus pour les isolats des types emm et emm. à emm types: voies -, M; voies -, M; voie, M; voie, M; voie, M; voie, sp / VT; voie, NS; voie, M; voie, AAL; voie, M; voie, M; voie, M; voie, M; voie, stI; voie, M; et voie, GGS LG

Discussion

emm et autres emm-comme les gènes et la digestion avec HaelII ou HinfI Parce que les scores de frappe vir diffèrent sur la base des gènes emm et comme emm, il peut être plus discriminatoire que emm-séquence en tapant pour tester une frappe vir clone a déjà été utilisé avec succès dans le Territoire du Nord de l’Australie à la place du typage M ou du typage EMM On a montré que le processus différenciait les différentes souches de GAS, et les résultats étaient corrélés avec le type M car le typage vir exige également l’information de séquence nucléotidique. technique pour identifier des isolats clonaux dans une collection des isolats qui ont été initialement typés, & gt; Étant donné qu’il n’existe actuellement aucune base de données vir avec les types emm correspondants, l’assignation de types emm à un type vir spécifique est impossible. Par conséquent, le séquençage du gène emm de chacun des isolats a été entreprise pour déterminer différents types emm de isolatesIn cette étude, les souches emm, emm, emm et emm représentaient% des isolats Quinze types ont représenté% des isolats La prédominance des GAZ isole dans cette étude est donc inférieure à celle vu dans d’autres études Six sérotypes M, M, M, M, M et M représentaient% de tous les isolats prélevés chez des patients atteints de pharyngite non compliquée recueillie aux États-Unis pendant la période de – Peu de rapports examinant la diversité de type emm hors de Les nations occidentales sont disponibles; la plupart soutiennent la présence de types d’EM prédominants Une étude communautaire en Corée examinant la diversité des souches de GAS à l’échelle communautaire a révélé que emm et emm représentaient% des isolats de GAS dans une région, alors que, dans une autre région, isolait M, M, M, et M représentaient% des isolats Une étude des types d’emm’s circulants au Mexique a rapporté que M, M et M représentaient% des isolats prélevés chez des patients présentant une pharyngite Nguyen et al ont également trouvé que les clones M et M En revanche, des études sur des isolats prélevés dans le Territoire du Nord de l’Australie ont révélé une plus grande diversité de souches de GAS . Les facteurs influençant la distribution épidémiologique de certains types de maladies n’ont pas encore été déterminés. Les stratégies vaccinales GAS utilisent plusieurs terminaisons amino-protéine M pour tenter de fournir une couverture à large spectre Plus récemment, Hu et al incluaient différentes terminaisons amino de ” Des souches significatives de GAS dans une formulation à épitopes multiples Six de ces types d’emm ont également été observés dans notre étude. Même si tous les types d’emm’s actuellement circulés sont couverts, il est hautement probable que de nouvelles souches non couvertes par le vaccin la région vaccinée et que les hôtes naïfs seraient colonisés Par conséquent, cette stratégie particulière semble avoir un très faible effet temporel sur l’infection par le GAS et ne sert qu’à modifier les types d’emmagasinements circulants de GAS Kaplan et al ont récemment rapporté le déplacement de M GAS avec M SGA dans une communauté particulière aux États-Unis, compliquant davantage la conception de vaccins amino-terminaux à protéine M pour des emplacements géographiques spécifiques Comme de plus en plus d’isolats de SGA sont collectés à des endroits très différents – en particulier dans les pays en développement toujours élevé-il est important de surveiller continuellement les types d’emm émergentsHomologie aux types d’emm existants est défini b y L’examen de la région amino-terminale des gènes emm, parce que cette région confère une identité sérotypique à chaque souche GAS. L’analyse des séquences génétiques complètes a montré que, bien que les extrémités amino puissent être identiques, des différences de séquence se produisaient toujours en aval. terminal, tous ont démontré% identité à l’autre tout au long des répétitions A, B et C du gène emm, mais ils contenaient des différences significatives de la région C-terminale de la souche de référence emm Un des isolats identifiés comme contenant le type de séquence NS également Les isolats trouvés identiques à emm à leur extrémité amino montrent également un grand degré de divergence. Un de ces isolats contenait des deletions et des nucléotides. Ces différences indiquent que, bien que le type de séquence emm puisse être similaire, la diversité génotypique dans types d’emm est encore observable Ces différences peuvent refléter des changements dans le gène seulement, ou ils peuvent être indicat En résumé, nous avons montré que, dans une communauté du nord de l’Inde, il y a un grand nombre de types de GAS emm circulants associés à des facteurs de pharyngite qui influent sur le nombre de types d’emm’s circulants dans un la communauté doit être mieux comprise Une telle information sera importante, en particulier parce que les candidats vaccins basés sur plusieurs terminaisons amino-protéine M se rapprochent d’être testés avec des essais humains.

Remerciements

Soutien financier Conseil indien de la recherche médicale à la HV, Conseil national de la santé et de la recherche médicale de l’Australie à MFG, et Conseil Australie-Inde Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: aucun conflit