"Dan Ferro has taught some of the most
important singers of the 20th Century"
Brian Zeger - The Juilliard School
The Metropolitan Opera

"Intensive study of vocal technique as applied to the literature for active singers"

Effets thermodynamiques et structurels des contraintes macrocycliques dans les interactions protéine

qui se lient à des protéines avec une forte affinité est l’un des principaux objectifs de la chimie médicinale. À cette fin, une tactique commune pour augmenter les affinités de ligand consiste à préorganiser les ligands dans leurs conformations biologiquement actives en introduisant des contraintes conformationnelles.1 Lorsque les peptides servent de point de départ pour de telles études, la préorganisation est généralement réalisée en introduisant des anneaux par une liaison latérale. et un atome de squelette, entre deux chaînes latérales, ou entre les extrémités N et C du peptide. Le raisonnement de cette approche doit son origine à la sagesse conventionnelle selon laquelle la liaison d’un ligand préorganisé devrait être favorisée de façon entropique par rapport à sa contrepartie plus flexible en raison d’une entropie conformationnelle réduite associée à des restrictions des rotors.2 À condition que les deux ligands interagissent Avec le solvant et la protéine (c’est-à-dire, Δ � 0; ∼ 0 kcal − 1), la molécule préorganisée devrait donc bénéficier d’une énergie libre de liaison plus favorable .Cependant, dans les études sur la liaison des peptides dérivés de la phosphotyrosine aux domaines Src et Grb2 SH2, nous avons découvert que la préorganisation du ligand peut avoir des conséquences entropiques favorables ou défavorables.3 − 5 Dans le contexte général de notre intérêt pour l’énergétique et la structure dans les interactions protéine et ligand, nous rapportons maintenant les effets énergétiques et structurels de l’introduction de contraintes conformationnelles macrocycliques pour préorganiser les ligands de liaison Grb2 SH2. Le domaine Grb2 SH2 lie les peptides contenant la séquence d’acides aminés pTyr-Xaa-Asn (pYXN) dans un type 1 Conformation de tour qui est stabilisée par une liaison hydrogène intramoléculaire entre l’atome d’oxygène carbonyle du résidu pY et l’atome d’azote de l’amide squelette du résidu pY + 3. Il a été montré que la macrocyclisation d’un peptide dérivé de la phosphotyrosine contenant la séquence pYVN peut imposer une telle structure retournée en solution, alors que le contrôle linéaire correspondant adopte une conformation de bobine aléatoire. mber de ligands cycliques ayant des tailles de cycle variant de 148 à 339 atomes ont ensuite été montrés se lier au domaine Grb2 SH2 avec une affinité élevée. Parce que les entropies et les enthalpies de liaison de ces macrocycles et de leurs contrôles linéaires n’ont pas été déterminées, les conséquences énergétiques détaillées de la préorganisation du ligand par macrocyclisation dans ces systèmes sont inconnues. En effet, Spaller et ses collègues ont rapporté une étude singulière qui comparait les enthalpies et les entropies de liaison pour la formation complexe de ligands macrocycliques et leurs contrôles linéaires avec le domaine PDZ3 de PSD-95.10. Pour définir explicitement les effets de la macrocyclisation comme une tactique pour préorganiser les ligands de liaison Grb2 SH2, il est nécessaire de comparer l’énergie de liaison et les structures des complexes de paires de ligands contraintes et flexibles ayant le même nombre et type d’atomes non hydrogènes, le même nombre de donneurs et d’accepteurs de liaison hydrogène, et mêmes groupes fonctionnels. Nous avons initié nos études avec les macrocycles 1 et 2 à 20 chaînons, qui contiennent respectivement les séquences d’acides aminés pYVNG et pYVNV et leurs témoins acycliques correspondants 4 et 5. Les dérivés de valine 2 et 5 ont été intéressants car plusieurs études structurales suggèrent que la chaîne latérale valine au site pY + 3 forme des contacts favorables de van der Waals avec le domaine Grb2 SH2.6,11 Les contrôles acycliques 4 et 5 et les précurseurs linéaires de 1 et 2 ont été synthétisés par des procédures simples de couplage peptidique, et les macrocycles 1 et 2 ont été préparés par cyclisation de leurs précurseurs d’acides aminés respectifs à l’aide de pentafluorophényl diphénylphosphinate.12 Les paramètres thermodynamiques (Ka, Δ G &#x000b0 ;, H ° , et Δ S °) pour la liaison des paires de peptides macrocycliques et linéaires 1/4 et 2/5 au domaine Grb2 SH2 ont été déterminées en utilisant la calorimétrie de titration isotherme (ITC) comme décrit précédemment (Tableau 1). 4 Le macrocycle 1 bou nd avec une affinité environ 10 fois plus faible que son témoin acyclique 4, principalement en raison d’une enthalpie de liaison beaucoup moins favorable pour 1. Les composés 2 et 5 liés avec approximativement la même affinité, et les enthalpies et entropies de liaison pour les deux ligands étaient comparables . L’incorporation d’un résidu valine au site pY + 3 a en effet conféré la liaison d’affinité supérieure attendue avec les constantes d’association pour 2 et 5 respectivement supérieures d’environ 50 et 6 fois à 1 et 4, respectivement. Tableau 1 Données thermodynamiques pour la liaison de Macrocyclic et des peptides acycliques contenant de la phosphotyrosine au domaine SH2 de Grb2 obtenus par ITC à 298 KaWe ont entrepris des études structurales de complexes de ces ligands avec le domaine Grb2 SH2 mais ont seulement pu obtenir des cristaux diffractables du complexe de 2. La structure du complexe de 2 a été résolu à 2.0 Å résolution, et il y a trois complexes coexistants dans l’unité asymétrique. L’analyse de ces complexes révèle que l’atome d’oxygène pY-1 carbonyle de 2 établit un contact polaire avec le fragment guanidinium du résidu de domaine Arg67 dans un seul des trois complexes. Cette découverte était totalement inattendue parce que cet atome d’oxygène carbonyle est impliqué dans deux contacts polaires directs avec la chaîne latérale de Arg67 dans tous les complexes connus de ligands dérivés de la phosphotyrosine liés au domaine Grb2 SH2. Sur la base des observations précédentes, nous avons pensé que un anneau à 20 chaînons dans des analogues cycliques de pYVNG (V) pourrait ne pas être suffisamment grand pour permettre des interactions protéiques et ligand optimales et, par conséquent, attirer notre attention sur des anneaux plus grands contenant un résidu d’acide aminé supplémentaire. Le macrocycle 3 à 23 chaînons et le contrôle linéaire correspondant 6 ont été synthétisés, et les paramètres thermodynamiques pour la liaison de 3 et 6 au domaine Grb2 SH2 ont été déterminés par ITC comme précédemment (tableau 1).Le macrocycle 3 se liait au domaine environ 20 fois mieux que son analogue 1 à 20 chaînons, et il présentait une affinité comparable, bien que légèrement plus grande, pour le domaine que son contrôle linéaire 6. Nous étions également intéressés par l’étude des 23- des analogues membranaires de 2 et 5 pour évaluer davantage l’énergie associée à l’incorporation d’un résidu de valine au site pY + 3, mais les insolubilités de ces composés nous ont empêchés d’obtenir des données ITC. En conséquence, nous avons porté notre attention sur le macrocycle dérivé de pYVNVP 7 et son contrôle linéaire 8. Nous avons été inspirés à cette fin par le travail d’Ettmayer et de ses collaborateurs, 7 qui avaient montré dans un bio-essai que Les études ITC de 7 et 8 révèlent que 7 était significativement plus puissant que tout autre ligand dans cette étude et lié avec environ 2 fois plus d’affinité que 8 (Tableau 1) .Une comparaison de la l’énergie de liaison pour les deux macrocycles à 23 membres 3 et 7 avec leurs contrôles acycliques correspondants révèle un fait intrigant. A savoir, la faible augmentation de l’affinité de liaison de 3 par rapport à son contrôle linéaire 6 plus souple provient d’une enthalpie de liaison relativement plus favorable qui remplace un terme entropique compensateur qui est moins favorable pour 3 que pour 6. D’autre part, la légère amélioration affinité de 7 par rapport à 8 événements car un terme entropique plus favorable pour la liaison de 7 domine un terme d’enthalpie compensatoire moins favorable que pour 8. Sur la base de ces observations, il est clair que la préorganisation des ligands dérivés de pYVN par macrocyclisation peut avoir un effet entropique favorable ou défavorable. Les effets entropiques variables de la préorganisation de ces ligands peuvent provenir de différences dans la nature et la flexibilité du fragment de liaison, qui n’interagit pas directement avec le domaine lui-même, qui relie les extrémités N et C. Une telle interdépendance de l’énergie de liaison sur la structure du linker a également été observée par Spaller et ses collègues dans leurs études de ligands macrocycliques et linéaires qui se lient au domaine PDZ3.10 Cependant, contributions associées à la variation du résidu pY + 4 de la glycine en valine dans les deux ensembles de ligands ne peuvent pas être exclus.On doit faire preuve de prudence dans l’interprétation des résultats de ces études thermodynamiques, car les différences dans Δ G ° car les ligands comparés sont petits. De plus, nous ne comprenons pas la base sous-jacente des fluctuations observées dans les enthalpies de compensation et les entropies pour la liaison des paires de ligands respectifs. Par exemple, 4 et 6, dont les structures diffèrent par trois groupes méthylène, se lient avec des affinités comparables même si leurs enthalpies et leurs entropies de liaison varient considérablement. Comme les amplitudes des variations de l’énergie de liaison de ces deux ligands linéaires ne sont pas trop différentes de celles des deux paires de ligands contraintes / flexibles 3/6 et 7/8, la signification des différences entropiques et enthalpiques observées pour la préorganisation de 6 et 8 est difficile à évaluer. Le paramètre thermodynamique Δ Cp, qui est la dépendance en température de Δ H &#x000b0 ;, est souvent corrélé dans les systèmes biologiques avec l’enfouissement des surfaces polaires et non polaires. Δ Les valeurs de Cp sont donc souvent comparées comme moyen de déterminer si des effets de désolvatation pourraient être impliqués dans l’énergétique de liaison différentielle.13 Les valeurs Cp de Δ pour 3 et 6 − 8 ont ainsi été déterminées et trouvées # x02212; 158.1 ± 7.7, − 199.8 ± 5.2, − 222.3 ± 3.2, et − 239.0 ± 13,5 cal mol − 1 K − 1, respectivement.14 Les différences de Cp pour la paire contrainte / flexible 3 et 6 sont donc significatives par rapport à l’erreur expérimentale, mais les valeurs de Cp pour 7 et 8 ne sont que légèrement en dehors de l’erreur expérimentale. Ainsi, des différences dans la thermodynamique de la liaison de 3 et 6 pourraient résulter en partie des différences de désolvatation, alors que la désolvatation jouerait peu dans l’énergétique différentielle de 7 et 8. Les structures tridimensionnelles du domaine Grb2 SH2 complexé avec 7 et 8 ont ensuite été déterminés par cristallographie aux rayons X à 1,8 et 1,9 Å résolution, respectivement, pour déterminer s’il y avait des différences dans leurs interactions avec le domaine (figure ​ (figure1) 1) qui pourrait être corrélée avec la différence observée dans les enthalpies de liaison de 2,0 kcal mol − 1. Il y a six complexes de 7 dans l’unité asymétrique, et ces complexes approximativement isoénergétiques peuvent être groupés en trois groupes conformationnels qui s’alignent avec une déviation moyenne quadratique moyenne (rmsd) de 0.5 Å pour tous les atomes du squelette, la principale différence étant dans les orientations relatives de la boucle BC. Les atomes du squelette dans chacun des six complexes coexistants de 7 s’alignent avec ceux du complexe de 8 avec des déviations rms similaires de 0,5 − 0.7 &#x000c5 ;. Comme il ressort de l’examen de la superposition de la figure 1a, la figure 1a, les hélices α et les feuilles β dans les complexes s’alignent étroitement, mais il y a quelques variations significatives dans le BC souple, CD , DE et BG. Les boucles CD et DE ne sont impliquées dans aucun contact avec les ligands, et la boucle BG est impliquée dans un seul contact protéine-ligand à médiation par l’eau dans seulement deux des six complexes coexistants de 7; par conséquent, il est difficile d’évaluer si ces dissemblances structurelles affectent l’énergie relative de liaison pour 7 et 8. L’orientation de la boucle BC, qui est impliquée dans de nombreux contacts directs et à médiation hydrique entre le domaine et 7 et 8, varie sensiblement en comparant les différents complexes de 7 avec 8. Cependant, ces dissemblances proviennent en grande partie des différences dans les six complexes coexistants de 7, de sorte que la corrélation de ces différences avec l’énergie de liaison de 7 et 8 est problématique. Les alignements structurels des conformations liées de 7 et 8 révèlent que les atomes appartenant à la séquence pYVN s’alignent avec un rmsd moyen de 0,3 Å (Figure ​ (figure 1b); 1b); ils sont donc pratiquement identiques. Il y a cependant des différences notables dans les positions relatives des autres atomes en 7 et 8, en grande partie parce que les atomes dans les parties N et C-terminales de 8 se projettent l’un contre l’autre.Figure 1Images de 7 et 8 liés au Grb2 Domaine SH2 suivant l’alignement du domaine. Les atomes d’oxygène, d’azote et de phosphore sont colorés en rouge, bleu et orange, respectivement. Les atomes de carbone appartenant aux complexes de 7 sont colorés en vert, tandis que ceux appartenant à … Pour corréler l’énergétique et la structure, nous avons inventorié les contacts polaires directs et uniques à médiation aqueuse et les contacts de van der Waals dans les complexes de 7 et 8. Il n’y a pas de différence dans le nombre de contacts polaires directs, mais le nombre de contacts à médiation par l’eau dans les six complexes coexistants de 7 et 8 varie d’environ ± Cependant, ces différences se traduisent par des différences dans le nombre de molécules d’eau ordonnées à l’interface protéine-ligand dans les complexes coexistants de 7, et non par des variations dans les positions des atomes appartenant au ligand et au domaine. Il n’y avait pas non plus de différences discernables dans les contacts de van der Waals entre le domaine et 7 et 8. Si l’on considère simplement les interactions protéine / ligand, il n’est donc pas possible d’identifier une base structurelle saine pour les différences observées dans les enthalpies de liaison. 7 et 8. Il y a, cependant, une différence notable dans une interaction de liaison hydrogène dans les structures liées de 7 et 8. A savoir, il y a une liaison hydrogène entre l’atome d’oxygène carbonyle du résidu pY et l’atome d’azote du squelette du pY + 3 résidu dans 8 qui manque dans chacun des six complexes coexistants de 7; cette liaison hydrogène intramoléculaire est observée dans les complexes du domaine Grb2 SH2 avec un grand nombre de ligands dérivés de pYVN.3,6,7 L’absence de cette interaction suggère que 7 pourrait se lier dans une conformation d’énergie supérieure à 8, un facteur qui est cohérent avec la pénalité enthalpique observée de la liaison pour 7 par rapport à 8. Ces résultats mettent en évidence notre manque de compréhension de l’énergétique et de la structure dans les interactions protéine / ligand, même dans des systèmes biologiques bien caractérisés. Par exemple, la comparaison des enthalpies et des entropies de liaison des macrocycles à 23 membres 3 et 7 avec ceux de leurs témoins linéaires respectifs 6 et 8 démontre clairement que la préorganisation du ligand n’est pas nécessairement favorisée de façon entropique comme cela est largement posé. La nature et la flexibilité du linker utilisé pour créer le macrocycle peuvent jouer un rôle, même si cette sous-unité n’interagit pas avec la protéine, un phénomène intéressant qui a déjà été observé10. Ces études soulignent également les problèmes associés à la corrélation entre / ou type de protéine − contacts de ligand avec des contributions spécifiques aux enthalpies et entropies de liaison. A savoir, les résidus d’acides aminés en 7 et 8 qui interagissent avec le domaine ont des structures pratiquement identiques, et ils font les mêmes contacts directs avec le domaine. Les différences mineures dans les contacts à médiation par l’eau observés lors de l’analyse des complexes de 7 et 8 proviennent des variations du nombre de molécules d’eau interfaciales dans les complexes coexistants de 7; les dissemblances dans ces complexes coexistants sont analogues à celles trouvées lors de la comparaison des complexes de 7 et 8. Cependant, certaines caractéristiques structurelles peuvent être corrélées avec les affinités de liaison. Par exemple, la comparaison des énergies de liaison de 4 et 5 révèle que l’introduction d’un résidu de valine à la position pY + 3 a un impact favorable sur l’énergie libre de liaison telle que prédit et que cette affinité accrue est entraînée par l’entropie.Ces études structurales suggèrent également que les affinités réduites des macrocycles à 20 membres pourraient être attribuées en partie à leur incapacité à former des contacts directs avec le domaine qui sont hautement conservés dans d’autres complexes. Enfin, la pénalité enthalpique associée à la liaison du macrocycle 7 par rapport à son contrôle linéaire 8 pourrait être partiellement attribuée à l’absence d’une liaison hydrogène intramoléculaire qui pourrait contribuer à la stabilité de la conformation liée de 7.