"Dan Ferro has taught some of the most
important singers of the 20th Century"
Brian Zeger - The Juilliard School
The Metropolitan Opera

"Intensive study of vocal technique as applied to the literature for active singers"

Dépistage des fragments par résonance plasmonique de surface

La découverte de médicaments à base de fragments (FBDD) est Maintenant, une méthode éprouvée pour la conception de candidats cliniques est comparable aux approches de dépistage à haut débit (HTS).Cependant, pour que la découverte de médicaments fragmentés devienne véritablement une innovation perturbatrice, le coût économique total d’un projet de découverte, de la production de protéines à la confirmation, doit être non seulement comparable à celui du STC, mais aussi plus rapide ou moins cher. Des techniques biophysiques telles que la cristallographie aux rayons X et la RMN sont couramment utilisées pour identifier les impacts de fragments de faible affinité. Malgré le plus petit nombre de composés qui doivent être examinés dans FBDD, le coût total réel du projet peut être comparable aux essais biochimiques à haut débit classiques, en raison du coût des méthodes d’analyse biophysique. Le besoin de structures cristallines à rayons X à haute résolution ou d’assignations de protéines RMN pour déterminer le mode d’action des fragments peut souvent introduire de longues lignes de temps depuis la conception du projet jusqu’à des données de criblage exploitables. En effet, il n’est pas rare que les chimistes médicinaux commencent à optimiser les hits dérivés de HTS de haute affinité pour une cible avant que les fragments biophysiquement dérivés soient disponibles, empêchant ainsi l’adoption de FBDD dans les organisations avec un investissement HTS significatif. En outre, la nécessité d’une forte consommation de protéines et, dans certaines expériences de RMN, de protéines marquées par isotopes entraîne des coûts importants pour un projet. La rentabilité de la DBF peut être améliorée en réduisant la quantité de protéines consommées, en réduisant la (3) réduire le nombre de faux positifs et (4) identifier les hits efficaces ligand.Biosensors, qui mesurent la cinétique des interactions protéine & ligand avec la résonance plasmonique de surface (SPR), émergent comme un Une nouvelle technique biophysique pour le criblage de fragments.4 − 10 La sensibilité et le débit de la nouvelle génération d’instrumentation SPR permettent d’utiliser cette technologie pour le criblage de grandes banques de fragments ou de composés. Le développement du criblage de fragments à base de SPR présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes actuelles de rayons X et de RMN. Premièrement, la consommation de protéines pour les méthodes SPR est au moins 10 à 100 fois inférieure à celle des autres méthodes de criblage de fragments biochimiques et biophysiques. Typiquement, des campagnes de criblage de fragments de SPR entières peuvent consommer aussi peu que 25 g de protéines. Deuxièmement, les tests d’interaction biophysique SPR peuvent être développés beaucoup plus rapidement que d’autres méthodes. Troisièmement, les méthodes SPR fournissent une caractérisation riche de chaque fragment en fournissant la cinétique et la thermodynamique de la liaison que la RMN et les rayons X ne peuvent pas fournir. Par exemple, non seulement SPR peut être utilisé pour identifier les fragments qui se lient mais cinétique et les analyses thermodynamiques Hoff peuvent identifier des fragments avec une cinétique de décalage lente12 ou se lier avec une énergie principalement enthalpique: des propriétés qui peuvent constituer de meilleurs points de départ pour l’optimisation. À ce jour, peu de criblages de fragments basés sur SPR ont été rapportés, y compris des campagnes de criblage contre BACE-1,6 MMP-12,7 thrombine8 et chymase.10 Nous étendons ici le développement de la méthodologie de criblage de biocapteurs utilisant l’anhydrase carbonique II (CAII) comme un système modèle, pour démontrer une méthode de référence de ligand-efficacité-based14 pour éliminer la détection de faux positifs et ainsi améliorer la rentabilité globale de biocapteur basé sur le criblage de fragments.Les technologies de biocapteurs SPR sont très sensibles, capables de détecter des fragments de petites molécules avec des poids moléculaires aussi faibles que 100 Da aux cibles biomoléculaires. Cependant, la conception d’analyse et l’analyse des données appropriées sont nécessaires pour distinguer la liaison réelle de la liaison non spécifique, en particulier lors de l’exécution d’un criblage à haut débit d’un grand nombre de molécules. En particulier, la sensibilité du test SPR au DMSO, un solvant avec un indice de réfraction élevé, peut être une source majeure de faux positifs si la concentration des échantillons et du tampon de fonctionnement n’est pas adaptée avec précision.15 Un avantage que la majorité des technologies SPR disponibilité de plusieurs canaux biocapteurs pouvant être utilisés pour analyser plusieurs protéines en parallèle. L’immobilisation parallèle de la cible, la ou les protéines de référence et laissant un canal blanc comme surface de référence permettent aux méthodes d’analyse de distinguer la liaison réelle et non spécifique. Dans cette étude, nous avons mesuré la liaison de 656 fragments à trois concentrations (16,6, 50, et 150 μ M) à la protéine CAII immobilisée et à la protéine SAP2k de référence immobilisée sur une surface de référence (voir Information de support). Le poids moléculaire (MW) de la bibliothèque de fragments variait de 94 à 341 Da, avec le MW moyen = 187 Da, correspondant à 13 atomes non hydrogène (lourds). Pour évaluer la stabilité des protéines et la reproductibilité des résultats, les composés témoins furosémide (positif) et SB 220025 (négatif) ont été injectés tout au long de l’expérience. Les réponses moyennes pour le furosémide et SB220025 étaient 5,58 (± 1,03) et − 0,36 (± 0,5) avec Z-prime moyen pour tous les essais 0,63 (± 0,14).Les variations des réponses tout au long de l’expérience ont été provoquées par des variations dans les conditions expérimentales et les niveaux d’immobilisation, car les expériences ont été divisées en 8 essais différents et trois puces ont été utilisées pour le criblage. Afin de réduire les faux positifs provenant de la liaison basée sur l’agrégation non spécifique sensible au détergent, 16 0,005% de Tween P-20 ont été ajoutés au tampon de migration dans toutes les expériences.17 Une excellente reproductibilité a été observée séparément pour chaque test (Figure S1a dans le Information). Toutes les expériences ont été réalisées sur un Biacore T100. L’ensemble de la campagne de criblage, depuis le développement du test jusqu’à la confirmation du succès, a nécessité un total de 4 semaines de consommation de chaque protéine. Au total, plus de 1960 sensorgrammes ont été collectés dans l’écran du fragment. Pour améliorer la vitesse et la qualité globales de l’analyse des données, nous introduisons une méthode de référence / filtre pour éliminer le bruit et les liants non spécifiques de la collecte de données afin de révéler des liants de fragments spécifiques. Les niveaux de réponse pour chaque sensorgramme de la phase de liaison d’association ont été extraits à 27 s après l’injection juste avant les dissociations (figure S1b dans l’information de support). A partir du tracé des niveaux de réponse pour chaque fragment à chaque concentration (figure ​ (figure la) 1a), il est évident que le nombre de liants non spécifiques augmente avec l’augmentation de la concentration. Comme l’analyse SPR repose sur la détection du changement de masse sur la surface du biocapteur, connaître la capacité superficielle maximale de la cible immobilisée permet de déterminer l’affinité approximative de la réponse obtenue pour chaque fragment (éq 1) .8 En supposant que chaque liant atteint l’état d’équilibre et basé sur une isotherme de Langmuir (éq 1), où la capacité de liaison maximale (Rmax) est de 40 RU (réponse de liaison maximale moyenne basée sur les données de saturation des hits réels), les affinités approximatives de chaque fragment à chaque La ligne de coupure est ajustée en conséquence.81où c correspond à une concentration à laquelle les fragments ont été filtrés.Figure 1Analyse des données de fragmentation: (a) Superposition des données de fragmentation pour la liaison référencée pour les flans et la cellule de flux de référence vide. Les fragments ont été injectés à trois concentrations: noir &#x025fc ;, 16.6 μ M; rouge ● 50 μ M; et vert &#x025b2 ;, 150 … Par conséquent, pour les fragments avec des affinités de liaison de 1 mM et plus, la ligne de coupure Req serait de 5 RU pour la concentration la plus élevée (150 μ M). Cependant, en plus d’identifier 12 liants confirmés, 230 faux positifs pour la concentration la plus élevée (données non montrées) sont également présents dans l’ensemble de données résultant (figure ​ (figure 1a) .1a). L’analyse des sensorgrammes révèle que de nombreux liants non spécifiques présentent des réponses non stoechiométriques17 à une protéine de référence immobilisée sur une cellule de flux de référence. Par conséquent, la soustraction des réponses recueillies sur la protéine de référence à partir de toutes les données résultant de la Figure 1b1b réduit significativement le nombre de faux positifs (équation 2). Le choix correct de la ou des protéines de référence est également important, car certains fragments peuvent réellement se lier à la fois aux protéines (cibles et de référence) et pourraient donc être manqués après la soustraction.2 En fixant la ligne de coupure à 5 RU, l’affinité minimale fragment montrant une réponse au-dessus de cette coupure à la concentration 150 μ M est 1 mM. Cependant, ce type d’analyse de coupure d’affinité peut ne pas convenir, car l’efficacité de la liaison par atome diffère pour chaque fragment. En calculant les valeurs d’efficacité du ligand (LE) 14, chaque fragment peut être analysé séparément en fonction de sa structure atomique, pour déterminer une valeur d’affinité appropriée pour chaque fragment individuel. L’efficacité du ligand (LE, Δ g) est calculée comme une énergie de liaison du ligand par atome (éq 3) .3 où Δ g est l’efficacité du ligand (cal mol − 1), N le nombre de non -hydrogène atomes dans la molécule, R la constante de gaz universel (1.986 cal K − 1 mol − 1) et température T (277,15 K ∼ 4 ° C ou 298,15 ∼ 25 ° C). Considérant carbonic anhydrase II composés sont caractérisés par des affinités élevées, 15 un rendement de ligand de Δ 0,333 kcal mol − 1 par atome non hydrogène à 4 ° C (LE = 0,333) a été choisi comme limite de coupure. Ainsi, la coupure LE produit une affinité minimale requise pour un fragment avec N = 13 atomes lourds moyens comme KD min = 0,385 mM (figure ​ (figure 1c) .c). En implémentant la référence d’efficacité du ligand dans l’équation 1, nous pouvons calculer le minimum requis pour chaque fragment (éq 4) .4Figure ​ La figure1d1d montre le calcul de la ligne de coupure basée uniquement sur le LE pour une molécule de 13 atomes être également appliqué spécifiquement non seulement à la concentration à laquelle les fragments sont criblés, mais aussi à une valeur atomique spécifique à chaque fragment.5Combinant les deux méthodes, où les données brutes sont référencées pour la surface avec la protéine de référence immobilisée et appliquant le filtrage LE (éq 5), on obtient la figure 2a, où chaque liant est étiqueté avec une lettre correspondant à chaque fragment fragmenté. En filtrant les points de données à travers le filtre LE, la majorité des fragments ressortent par rapport aux non-relieurs qui sont filtrés hors de l’ensemble de données. Seuls quatre faux positifs (fragments X, Y, W, Z) ont été observés et identifiés par la suite comme des liants non spécifiques en raison de réponses sensorielles non stoechiométriques (figure ​ (figure 2b) .2b). La comparaison complète de quatre méthodes d’évaluation différentes est résumée à la figure ​ Les détails de chaque méthode sont décrits dans la légende et sont basés sur l’utilisation de soustractions uniques ou combinées d’ensembles de données brutes pour les valeurs calculées à l’aide des équations 1 − 5. Les meilleurs résultats ont été obtenus en combinant la méthode de référence de la surface de la protéine avec le filtre LE, comme le montre la figure  En utilisant cette méthode, nous avons identifié 12 liants spécifiques à CAII donnant un taux de succès de dosage de 1,8%. Des taux de réussite similaires ont été observés pour d’autres protéines dans des filtres à base de RMN et de rayons X.18 Tous les liants ont été confirmés en injectant des dilutions en série de 3 fois de chaque fragment allant de 150 ° C à 0,022 ° M. CAII présente une bonne stabilité à 25 ° C une fois immobilisé en surface, 15 cependant le criblage de fragments est conduit de manière optimale à 4 ° C car toutes les cibles ne sont pas stables pendant toute la durée du test. Cela peut également être avantageux, en particulier pour les liants faibles, car ils peuvent être mieux identifiés à des températures plus basses en raison de changements dans la courbure des sensorgrammes. Tous les liants ont ensuite été caractérisés à la fois à 4 et 25 ° C et la cinétique et l’affinité ont été comparées. Toutes les données ont été ajustées à un modèle de liaison 1: 1 incluant le coefficient de transport de masse (Figure ​ (Figure4) .4). Les résultats confirmés affichaient une large gamme d’affinités (0,13 − 14 μ M). L’analyse cinétique a identifié certains fragments présentant des vitesses de ralentissement très élevées à 4 ° C (par exemple, le fragment L et la figure 2a avec kd = 0,003 s). Figure ​ La figure 55 montre un graphique de corrélation pour kd vs ka avec des isothermes d’affinité. A la température la plus élevée, les points de chaque fragment se déplacent vers des vitesses cinétiques plus élevées, mais comme l’affinité est calculée comme le rapport entre kd et ka, la plupart des fragments conservent approximativement la même affinité (KD) à 4 et 25 ° .11 Figure 2 (a) Superposition de réponses fragmentées référencées en utilisant eq 5 pour les fragments se liant à CAII aux concentrations 16.6, 50 et 150 μ M. Les points marqués en jaune foncé représentent les liants confirmés. Les liants non spécifiques X, Y, W et Z sont mis en surbrillance dans les cercles. … Figure 3 Comparaison de quatre méthodes d’analyse différentes pour le dépistage des fragments. Les nombres de fragments présentant des réponses supérieures à 0 RU à trois concentrations (16,6, 50 et 150 μ M) sont tracés en fonction des concentrations de criblage. Chaque barre représente l’analyse individuelle … Figure 4Overlay de sensorgrams pour chaque liaison confirmée de liaison à CAII mesurée en double à 4 et 25 ° C. Les lignes noires représentent les courbes de liaison mesurées; les lignes rouges représentent un ajustement cinétique de 1: 1. Chaque composé est étiqueté par une lettre correspondant à des liants … Figure 5Kinetic values ​​plot of kd vs ka. Les lignes pointillées représentent les isothermes d’affinité. Les carrés noirs représentent les données recueillies à 4 &#x000b0, les données de carrés C et rouges collectées à 25 ° Les points de données sont étiquetés selon la figure ​ Figure 44 pour chaque fragment. … L’analyse par biocapteur basé sur SPR est en train de devenir une technique importante pour la découverte de médicaments à base de fragments. En plus des avantages de la faible consommation de protéines et du développement rapide des dosages, la technologie SPR a le potentiel d’éliminer pratiquement tous les liants non spécifiques (faux positifs) en mettant en œuvre toutes les étapes nécessaires pour la conception, l’analyse et l’interprétation des données. La réalisation d’écrans de fragments SPR avant l’analyse par rayons X et RMN fournit non seulement des fragments pour l’optimisation de la chimie médicinale, mais fournit également des ligands utiles pour la cristallisation des protéines d’ensemencement et l’évaluation quantitative de la pharmacocinétique, spécialement pour les nouvelles protéines de structure non résolue alcoolodépendance.