"Dan Ferro has taught some of the most
important singers of the 20th Century"
Brian Zeger - The Juilliard School
The Metropolitan Opera

"Intensive study of vocal technique as applied to the literature for active singers"

d-Acide aminé Inhibiteurs De La Protéine Arginine Deiminase: Synthèse, Pharmacocinétique, Et En Cellulo Efficacité

Les protéines subissent une foule de post-traductionnel

modifications, y compris l’acétylation, la phosphorylation, la méthylation,

ubiquitination, et citrullination.1 Catalyzed

par la famille d’enzymes protéine arginine déiminase (PAD), citrullination

ou la dégradation est l’hydrolyse de la peptidyl-arginine en peptidyl-citrulline.

Il y a cinq isozymes de PAD chez l’homme et d’autres mammifères (PAD 1 – 4

et 6), et tous les cinq PAD sont des enzymes dépendantes du calcium.2,2b Les PAD sont distribués dans plusieurs types de tissus, et tandis que

toutes les isozymes sont cytoplasmiques, seules les PAD2 et PAD4 sont exprimées

à la fois dans le cytoplasme et le noyau, où ils modifient la transcription des gènes via leur capacité à citrulliner

histones H3 et H4.4 Les PAD sont particulièrement

intrigant compte tenu de leur rôle dans une foule de maladies auto-immunes et inflammatoires

maladies, y compris la polyarthrite rhumatoïde (PR), la colite ulcéreuse,

cancer du sein, et la maladie d’Alzheimer, entre autres.2,2bWe et d’autres ont développé un certain nombre de PAD à base d’halo-acétamidine

inhibiteurs 5 − 5g l’ogive halo-acétamidine modifie de manière covalente le site actif

cystéine dans les PAD pour inhiber de façon irréversible l’activité enzymatique. Du

inhibiteurs de la PAD de première génération, la Cl-amidine s’est avérée la plus utile.5e Cet inhibiteur pan-PAD réduit la gravité de la maladie

dans le modèle de la polyarthrite rhumatoïde induite par le collagène (CIA) 6, ainsi que dans un modèle murin de colite ulcéreuse7 carie. En outre, la Cl-amidine a été utilisée pour confirmer que

PAD4 joue un rôle essentiel dans le piège extracellulaire des neutrophiles (NET)

formation; La Cl-amidine prévient la citrullination des histones, la décondensation de la chromatine,

et formation ultérieure de NET.8,8b D’autres tests et

la caractérisation de ces inhibiteurs a conduit à l’identification de

un inhibiteur sélectif PAD3, Cl-4-amidine.5c Dans le but de produire des inhibiteurs plus puissants, deuxième génération

Les analogues de la Cl-amidine ont été synthétisés, en utilisant les principes de

conception et structure – relations d’activité. Ce travail déterminé

cette incorporation d’un ortho-carboxylate sur le

fragment benzoyle de Cl-amidine a considérablement augmenté la puissance (par

jusqu’à 65 fois) de ces inhibiteurs.5 Bien que ces composés soient de puissants inhibiteurs de la PAD, leurs structures à base d’acides aminés L laissent potentiellement

protéolyse.9 Pour cette raison, ils ont

relativement courtes demi-vies in vivo et perdent la puissance cellulaire tout à fait

rapidement. Compte tenu du précédent de l’utilisation des acides aminés d dans

composés à base de peptides pour améliorer la stabilité, nous avons émis l’hypothèse que la prochaine génération

Les analogues de la Cl-amidine incorporant des acides D-aminés produiraient

Les inhibiteurs de la PAD avec une stabilité améliorée et des sélectivités uniques. À

à cette fin, une série de huit Cl-amidine à base de d-aminoacides

analogues ont été synthétisés et testés contre les PAD 1 – 4 pour caractériser

leur puissance et leur sélectivité. Les meilleurs inhibiteurs de cette série

sont d-Cl-amidine et d-o-F-amidine,

comme ils présentent une sélectivité améliorée pour PAD1 sur les PAD 2 – 4

et amélioré dans l’efficacité cellulo dans les cellules MDA-MB-231 et montrent une modérée

augmentation de la stabilité. Ici, nous rapportons également pour Cl-amidine, d-Cl-amidine, et d-o-F-amidine le

dose maximale tolérable (DMT) et les résultats de cellulo et pharmacocinétique

Étant donné que la F-amidine, la Cl-amidine, la o-F-amidine et la o-Cl-amidine ont été les

inhibiteurs utiles de PAD, 5,5e nous avons initialement synthétisé leur

dérivés directs utilisant la d-ornithine, par opposition à la l-ornithine, comme matière de départ (figure 11 et schéma S1 dans l’information complémentaire) Ces composés sont désignés dF-amidine, d-Cl-amidine, doF -amidine, et do-Cl-amidine, le “ d ”

la stéréochimie altérée. Pour évaluer leur puissance in vitro, les valeurs kinact / KI

ont été déterminées pour chaque composé avec les quatre isozymes actives de la PAD,

c’est-à-dire, PADs 1 – 4 (Figure ​ (Figure2) .2). Notez que

PAD6 n’a pas été testé car il ne montre aucune activité in vitro. Sur le

base de cette analyse, la d-Cl-amidine et la d-o-F-amidine sont les composés les plus puissants et les plus sélectifs

de cette série initiale. Par exemple, ces composés préférentiellement

inhiber PAD1, par ≥ 10 fois, avec des valeurs kinact / KI de 13500 et 12100 M – 1 min – 1, respectivement (Figure ​ (Figure2) .2). Compte tenu de la stéréochimie altérée et la préférence pour PAD1, nous

expériences de dialyse utilisées et profil de protéines basé sur l’activité compétitive

(ABBP) pour confirmer qu’ils inhibent de façon irréversible cette isozyme (Figures

S1 et S2 dans les informations de support, respectivement). Aucune activité enzymatique n’a été observée après la dialyse,

et les composés ont efficacement concurrencé le marquage par la rhodamine-conjuguée

Cl-amidine (RCA), un ABPP dirigé par site actif. Il devrait aussi être

a noté que la d-Cl-amidine et la d-o-F-amidine présentaient des courbes d’inhibition sigmoïdales lorsque l’inhibition

des expériences ont été réalisées avec PAD1 (Figure S3 dans les Informations de Support). Bien que ce type de

aucune inhibition n’a été observée pour les autres cas précédemment signalés

Inhibiteurs de la PAD, les PAD sont connus pour se dimériser, 11 et il est possible que ces composés induisent une intrasubunité

coopérativité, via un changement conformationnel lors de l’inhibition d’un

sous-unité du dimère, qui rend la deuxième sous-unité plus sensible

à l’inhibition. D’autres études sont nécessaires pour confirmer cette hypothèse.

des composés de la série D. Figure 2: sélectivité de l’inhibiteur. valeurs de kinact / KI, déterminées avec purifié

enzyme, sont affichés graphiquement et sous forme de tableau (encart) pour

les composés de la série D, ainsi que certains l-amino

analogues de l’acide, indiquant la puissance et la sélectivité pour les PAD 1 – 4. … Bien que la d-Cl-amidine et la d-o-F-amidine soient généralement moins puissantes que leurs homologues l, les composés de la série D présentent une PAD1 améliorée.

sélectivité par rapport à leurs contreparties l-aminés (figure ​ (figure2) .2). Par exemple, l-Cl-amidine est seulement 3 fois

sélectif pour PAD1 sur PAD4, alors que d-Cl-amidine montre

environ 10 fois la sélectivité entre ces deux isozymes. L’augmentation

sélectivité pour PAD1 n’est pas limitée à PAD4, comme l’inversion de

la stéréochimie stimule également la sélectivité contre les PADs 2 et 3 à 50-

et 200 fois, respectivement. Des tendances de sélectivité similaires sont observées

avec la d-F-amidine, mais avec une puissance réduite,

avec les données pour la l-F-amidine; le kinact / KI pour PAD1 est seulement 1220

M – 1 min – 1. Fait intéressant, la d-o-Cl-amidine et la d-o-F-amidine présentaient les tendances de puissance opposées, la d-o-Cl-amidine montrant une inhibition limitée envers

l’un des PAD, tandis que la d-o-F-amidine était

le deuxième inhibiteur de la PAD1 le plus puissant testé parmi les analogues d.

Même si le chlorure est un meilleur groupe partant que le fluor, cette

le résultat n’est pas sans précédent (par exemple, Thr-Asp-F-amidine

puissance et la sélectivité que Thr-Asp-Cl-amidine) 5b et reflète probablement les contraintes stériques de l’actif

site favorisant le plus petit groupe partant, à la suite de l’inversion

de stéréochimie. Plus significativement, la d-o-F-amidine inhibe préférentiellement PAD1 de 35, 3900 et 225 fois

par rapport aux DPA 2, 3 et 4, respectivement, ce qui en fait le plus sélectif

PAD1 inhibiteur jamais découvert (Figure ​ (Figure22). Des études précédentes ont démontré que la longueur de l’éditeur de liens entre le

épine dorsale peptidique et l’ogive halo-acétamidine prête des inhibiteurs

En tant que telles, les versions d-aminoacides de Cl2-amidine (deux méthylène linker)

et Cl4-amidine (quatre méthylène linker) ont également été synthétisés (figure ​ (figure1) .1). Cependant, ces composés étaient des inhibiteurs assez pauvres

(kinact / KI < 150 M – 1 min – 1) pour tous

des PAD testés (Figure ​ (Figure2) .2). Cela souligne

l’importance de la longueur du linker dans la conception des inhibiteurs de la PAD,

est la distance entre l’ogive halo-acétamidine, qui réagit

avec le site actif cystéine, et le squelette peptidique est critique

pour une inhibition puissante. Étant donné que le groupement carboxylate de l-o-F-amidine et l-o-Cl-amidine

interagit favorablement avec Trp347 dans PAD45 et que l’inversion du stéréocentre pour le d-amino

les inhibiteurs d’acide peuvent renverser l’orientation de l’inhibiteur dans l’enzyme

site actif, nous avons émis l’hypothèse qu’une charge négative sur le C-terminal

des inhibiteurs de l’acide d-aminé peut augmenter la puissance de

ces inhibiteurs. Pour cette raison, d-Cl-amidine-OH et d-Cl-amidine-Gly ont été synthétisés (figure ​ (figure 1) .1). Cependant, ces composés étaient aussi de faibles inhibiteurs de PAD (Figure 2; 2; kinact / KI < 230 M – 1 min – 1). Bien que ce résultat puisse suggérer que les inhibiteurs ne

se lier à l’enzyme dans l’orientation opposée, par rapport à leurs homologues l-aminés, des études structurelles seront nécessaires

pour confirmer leurs véritables modes de liaison. Alors que d-Cl-amidine-OH

s’est avéré être un piètre inhibiteur pour tous les PAD, il est

intéressant de noter que pour PAD1 l’isostère d’amide est 60 fois plus

puissant. Ainsi, si l’hydrolyse de l’amide C-terminal se produit à un niveau appréciable

quantité au cours de la décomposition initiale de ces composés, l’hydrolyse

de ce lien in vivo entraînerait une perte significative de puissance,

avec des effets conséquents sur l’efficacité in vivo. Le fait que L-Cl-amidine-OH

est également un inhibiteur PAD pauvres (Figure S4 dans les Informations de Support) suggère qu’une ventilation similaire

voie réduirait l’efficacité in vivo de Cl-amidine. Étant donné que

la structure de base de L-Cl-amidine est similaire à celle de benzoyl-arginine amide,

un substrat classique pour plusieurs protéases dirigées par l’arginine, nous

Hypothèse que l’amide C-terminal peut être protéolyzed in vivo. Ayant identifié d-Cl-amidine et d-o-F-amidine comme le plus

inhibiteurs prometteurs de PAD1 dans cette série, nous avons examiné la pharmacocinétique

et pharmacodynamique de ces deux composés. La l-Cl-amidine était

utilisé comme référence. Au départ, nous avons déterminé que le MTD devait examiner

effets physiologiques de ces composés sur des souris lorsqu’elles sont administrées par voie orale.

Le poids corporel total change, ainsi que des changements physiologiques observables

de souris qui ont reçu des doses variables de ces composés, donnés par

os, sont présentés dans les tableaux S1 – S3 dans le support

Information. Beaucoup de souris dans ces études ont montré des signes

de toxicité (par exemple, selles molles et sanglantes) à des concentrations plus élevées

d’inhibiteur, la toxicité observable la plus importante étant

dans le groupe 6 de la l-Cl-amidine, où les souris tremblaient notablement,

anxieux, voûté et respirant fortement de 1 à 4 h après le traitement.

Par la suite, de tels signes et symptômes se sont dissipés, et ces souris ont développé

diarrhée ou selles molles qui ont duré 2 jours. Souris recevant

100 mg / kg (groupe 5) et 150 mg / kg (groupe 6) l-Cl-amidine

avait une perte de poids significative 4 jours (96 h) après la consommation de l-Cl-amidine (Figure ​ (Figure3) .3). Cependant, les souris ayant reçu la d-Cl-amidine ou la d-o-F-amidine maintenues

gains de poids en bonne santé, similaires à ceux des souris n’ayant aucun composé

(Figure ​ (Figure3) .3). Compte tenu de la définition du MTD

(c’est-à-dire, la plus forte dose d’un composé qui ne provoque pas de perte de poids

ou signe significatif de toxicité), nous concluons de cette étude que

la DMT de la l-Cl-amidine chez la souris est de 75 mg / kg et la DMT de

les deux composés de la série d testés sont supérieurs à 150 mg / kg,

la plus forte dose testée. Bien que pas clair pourquoi les composés synthétisés

à partir des acides aminés D ont des valeurs MTD plus élevées, il est possible

que le métabolisme de la l-Cl-amidine génère un métabolite toxique

cela n’est pas produit aussi rapidement pour les composés de la série D.

Nous notons que 100 mg / kg de l-Cl-amidine ont été administrés à

souris par IP jusqu’à 56 jours dans nos études précédentes sans

signes observables de toxicité.6,7Figure 3MTD études. Les composés de la série D sont mieux tolérés in vivo que la l-Cl-amidine

dans les études MTD. Graphique du pourcentage de variation du poids corporel des souris (n = 10) avec des doses variables de l-Cl-amidine, de d-Cl-amidine et de d-o-F-amidine. UNE

diminution significative (* P valeur … L’efficacité des deux inhibiteurs les plus puissants, d-Cl-amidine et d-o-F-amidine, était

prochain testé dans les cellules MDA-MB-231, une cellule de cancer du sein triple négatif

ligne. La l-Cl-amidine a de nouveau été utilisée comme composé de référence.

Les cellules MDA-MB-231 ont été choisies pour ces études car ces cellules

surexprimer PAD1 (Figure S5 dans le

Information). Tous les composés ont été testés à des concentrations variables

(c’est-à-dire, 100, 200 et 400 μ M), et diverses mesures de l’efficacité des médicaments

ont été évalués (c.-à-d., le pourcentage de viabilité cellulaire, le nombre de cellules et la caspase

3 activité; Figure ​ Figure4) 4) 96 h après l’administration.

Les deux l-Cl-amidine et d-Cl-amidine étaient efficaces

en diminuant significativement la viabilité cellulaire à des concentrations de 200

et 400 μ M (valeur de P < 0,01; tableau S2 dans les informations de support). De même, les deux composés

diminution significative du nombre de cellules à une concentration de 400 μ M

(Valeur P < 0,05; Tableau S2 dans les Informations de support). Malheureusement, le plus sélectif

composé in vitro, la d-o-F-amidine, avait peu

efficacité en cellulo; nous avons observé aucun effet sur la viabilité cellulaire et seulement

une petite diminution du nombre de cellules à une concentration de 400 μ M

(Valeur P < 0,05; Tableau S2 dans les Informations de support). Le carboxylate chargé négativement

limite probablement l’absorption cellulaire.Figure 4 Études d’efficacité cellulaire. l-

et d-Cl-amidine montrent une puissance égale contre PAD1 surexprimant

Cellules MDA-MB-231, diminuant la viabilité cellulaire (A) et le nombre de cellules

(B). (C) Les deux l- et d-Cl-amidine augmentent la caspase

3 activité, indiquant que l’inhibition de … Pour élucider si ces inhibiteurs induisaient

l’apoptose et / ou l’inhibition de la prolifération, l’activité de la caspase 3 et Ki-67 a été contrôlée dans des cellules MDA-MB-231. Augmenté

l’activité de la caspase 3 est une caractéristique de l’apoptose, 12 tandis que Ki-67 est nécessaire pour

maintien de la prolifération cellulaire, et une diminution de Ki-67, seulement visible pendant la phase G0, est indicative

de l’arrêt du cycle cellulaire.13 Tous les composés

testé (c’est-à-dire, l-Cl-amidine, d-Cl-amidine et d-o-F-amidine) n’a pas eu d’effet significatif sur les taux de Ki-67 (figure S6 dans les informations de support). Seulement des quantités accrues de tunicamycine,

un contrôle positif de l’arrêt du cycle cellulaire, a entraîné une diminution des niveaux de Ki-67. Cependant, les deux l-Cl-amidine

et d-Cl-amidine a augmenté l’activité de la caspase 3, de

d’une manière dose-dépendante, avec une augmentation significative de l’activité

à une concentration de 400 μ M (figure ​ (figure 4C; 4C; valeur de P < 0,01; tableau S1 dans les informations de support).

vu dans les études sur le nombre et la viabilité cellulaires, le traitement par d-o-F-amidine n’a pas entraîné d’augmentation de l’activité de la caspase 3. Pris ensemble, ces données indiquent que la d-o-F-amidine est modérément puissante et hautement sélective in vitro,

il a une faible efficacité en cellulo. Le manque d’efficacité in cellulo avec

ce composé est probablement dû à une mauvaise absorption cellulaire, ce que nous supposons

est causée par la présence du carboxylate chargé négativement et

manque de caractère hydrophobe. Les données indiquent également que bien que la l-Cl-amidine et la d-Cl-amidine aient des

Potences in vitro vers PAD1 (kinact / Ki = 37000 et 13500 M – 1 s – 1, respectivement), ces composés ont relativement

égal dans les puissances de cellulo. Le fait que d-Cl-amidine est

plus sélectif que la l-Cl-amidine suggère que ce composé

sera utile pour étudier l’activité PAD1 in vivo, car son utilisation

Comme la stabilité de plusieurs inhibiteurs à base d’acides aminés a été améliorée par la synthèse de mimétiques à base de d-aminoacides, nous avons ensuite comparé la stabilité

propriétés pharmacocinétiques de l- et d-Cl-amidine.

Nous nous sommes concentrés sur la d-Cl-amidine parce qu’elle est la plus puissante

dans cellulo PAD1 inhibiteur de la série d de composés.

Initialement, la stabilité de l- et d-Cl-amidine

a été testé dans un test de stabilité du microsome hépatique murin. Ce test

utilise des microsomes du foie, qui possèdent plusieurs des enzymes responsables

pour le métabolisme des médicaments in vivo, et sont un prédicteur initial commun de

propriétés de dédouanement des médicaments.14 Les résultats

de ce test indiquent que les deux l- et d-Cl-amidine

ont des demi-vies similaires (37 et 33 min, respectivement) (Figure ​ (Figure5A), 5A), indiquant que l’inversion du stéréocentre

n’a pas amélioré la stabilité de Cl-amidine dans ce test. La pharmacocinétique

les propriétés des deux l- et d-Cl-amidine étaient alors

examiné chez la souris par intraveineuse (iv) et intrapéritonéale (ip)

méthodes d’injection (Figure ​ (Figure5B) .5B). Ces données indiquent

que la l-Cl-amidine, administrée iv à la dose de 10 mg / kg,

est complètement dégradé en 2 h. Cependant, d-Cl-amidine,

administré par voie intraveineuse à la dose de 2,5 mg / kg, était encore détecté après

2 h dans le sérum à une concentration de ∼ 21 nM et à 4 h à ∼ 10

nM. l-Cl-amidine, administrée par voie ip à la dose de 10 mg / kg,

était complètement dégradé en 4 h. Similaire aux résultats pour iv, la d-Cl-amidine était encore observée dans le sérum sanguin à une concentration

de ∼ 10 nM à 4 h lorsqu’il est administré par voie ip à la dose de 10 mg / kg.

Ces données indiquent que la d-Cl-amidine est significativement plus

stable dans un modèle de souris par rapport à la l-Cl-amidine.

Cette augmentation de la stabilité est probablement due à une diminution de la protéolyse

du stéréocentre inversé.Figure 5Stabilité et études pharmacocinétiques. (A) Le

La stabilité de la d-Cl-amidine dans les microsomes hépatiques de souris est

similaire à Cl-amidine. (B) Les niveaux plasmatiques moyens de Cl-amidine et de d-Cl-amidine chez la souris au fil du temps, administrés par injection intraveineuse et ip. Pris ensemble, ces données représentent une nouvelle classe

d’inhibiteurs de la PAD avec une sélectivité accrue pour PAD1 et une augmentation

stabilité in vivo et tolérance. Bien que trouvé dans la peau où

il joue un rôle indéfini dans la kératinisation de la peau, peu

d’autre est connu concernant les rôles normaux et pathologiques de PAD1.2 Ainsi, ces inhibiteurs sélectifs de PAD1

seront des composés d’outils importants qui peuvent être utilisés pour obtenir un aperçu

dans la fonction de cette isozyme. Ici, nous avons montré que

huit composés de la série d synthétisés, d-Cl-amidine

et d-o-F-amidine, sont modérément puissants

et hautement sélectif pour PAD1 in vitro. Les études MTD indiquent que

ces composés sont mieux tolérés dans les modèles animaux que la l-Cl-amidine, peut-être en raison de leur stabilité protéolytique inhérente.

En outre, nous montrons que d-Cl-amidine, bien que moins puissant

in vitro, est aussi puissant en cellulo que comparé à la l-Cl-amidine

et montre une meilleure pharmacocinétique. Ces propriétés font des inhibiteurs de la PAD à base de d-aminoacides une option viable pour améliorer

futures classes de composés. Les efforts actuels sont axés sur l’expansion

sur ces résultats pour augmenter la demi-vie, la biodisponibilité, et

perméabilité cellulaire à la fois des acides l et d

Inhibiteurs de la PAD.