"Dan Ferro has taught some of the most
important singers of the 20th Century"
Brian Zeger - The Juilliard School
The Metropolitan Opera

"Intensive study of vocal technique as applied to the literature for active singers"

Chiffre d’affaires des composants adipeux et de l’ADN mitochondrial chez l’homme: biomarqueurs cinétiques de la lipodystrophie associée au virus de l’immunodéficience humaine et de la toxicité mitochondriale

Lipoatrophie LA / lipodystrophie et inhibiteur nucléosidique de la transcriptase inverse Le syndrome associé aux INTI est d’une importance capitale dans le virus de l’immunodéficience humaine VIH / syndrome d’immunodéficience acquise Sida Aucun de ces états n’a une pathogenèse ou un biomarqueur clairement défini pour la détection précoce, la gestion du patient Je décris le développement récent de biomarqueurs cinétiques pour LA et la toxicité mitochondriale qui impliquent la mesure des flux biosynthétiques plutôt que des concentrations statiques de molécules. Le taux de renouvellement des lipides des tissus adipeux et des cellules et tissus mitochondriaux est mesuré par l’incorporation de deutérium. Les résultats préliminaires sur les modèles animaux et les humains, y compris les effets des INTI sur la synthèse de l’ADN mitochondrial chez le rat et la cinétique des lipides des tissus adipeux dans les LA associées au VIH, sont examinés. Les résultats suggèrent que la cinétique des composants adiposetissue et mitochondriale L’ADN est moi inurables in vivo et que ces mesures peuvent s’avérer utiles en tant que biomarqueurs cliniques chez des patients atteints du VIH / SIDA

Toxicités associées au traitement antirétroviral Les antirétroviraux sont parmi les problèmes les plus importants dans les soins et la recherche contemporains sur le VIH / SIDA. Les syndromes attribués, au moins en partie, aux agents utilisés dans les traitements antirétroviraux comprennent la lipoatrophie / lipodystrophie LA / LD, hyperlipidémie, résistance à l’insuline et toxicité mitochondriale En plus des morbidités directes liées à ces toxicités, les risques à long terme de maladies secondaires peuvent être accrus, p. ex. maladie cardiovasculaire athéroscléreuse et diabète sucré. Tout aussi important, les symptômes ou les maladies secondaires peuvent contribuer à Les résumés des besoins de recherche dans le VIH / SIDA listent les toxicités de l’ART comme des priorités ou des priorités , pour toutes ces raisons. Deux syndromes, en particulier, sont relativement nouveaux et sont actuellement sans options de traitement efficaces établies-LA / LD et un inhibiteur nucléosidique de la transcriptase inverse NR Parce que les traitements efficaces contre ces maladies n’ont pas encore été développés, la prévention peut être la stratégie la plus efficace. La prévention nécessite des mesures diagnostiques qui sont à la fois définitives et présentes au début de l’évolution de la maladie, cependant, si des patients à risque doivent être identifiés avant que des complications avancées ne se produisent Malheureusement, des biomarqueurs objectifs de dysfonctionnement mitochondrial ou LA n’ont pas encore été identifiés Sans biomarqueurs fiables de la pathogenèse sous-jacente, identification précoce des patients sur le chemin des complications à long terme L’efficacité des stratégies d’intervention, en général, est difficile à évaluer sans des mesures intermédiaires qui peuvent être évaluées en deçà des résultats cliniques finaux. points d’extrémité T La stratification des populations de patients pour les essais cliniques par activité de la maladie, les ajustements posologiques pendant les essais et l’analyse subséquente des réponses métaboliques par rapport aux non répondeurs sont souvent grandement facilitées par la disponibilité de biomarqueurs précis. La disponibilité des biomarqueurs de l’activité et / ou du risque donc clairement être utile pour ces syndromes liés aux ARV Bien que les dysfonctionnements mitochondriaux associés à l’AL et aux INN n’aient pas de pathogenèse prouvée, des mécanismes biochimiques ont été proposés pour chacun. La mesure d’un processus biochimique sous-jacent contribuant souvent à la pathogenèse Une approche optimale de la surveillance diagnostique et de l’identification des facteurs de risque Dans le présent article, nous discuterons des travaux récents sur le développement de biomarqueurs pour les dysfonctions LA et mitochondriales. L’approche de mesure utilisée ici implique des biomarqueurs cinétiques – des mesures de flux biosynthétiques plutôt que de niveaux statiques de mo lecules La base théorique et les premiers progrès expérimentaux pour chaque trouble seront passés en revue. Je passerai d’abord en revue la cinétique des tissus adipeux dans le contexte de l’AL associée au VIH, puis le renouvellement mitochondrial dans le contexte des toxicités associées aux INTI.

CHIFFRE D’AFFAIRES DE LIPIDES ET DE CELLULES DE COMPOSES TISSULAIRES ADIPEUX

Le tissu adipeux est composé principalement de ~% d’une molécule unique de triacylglycérol [TG] présente dans une matrice cellulaire. Les cellules du tissu adipeux comprennent les adipocytes matures, dans lesquels la TG est stockée, et les éléments stromal-vasculaires, qui comprennent les préadipocytes, les fibroblastes, les cellules endothéliales. La cinétique de renouvellement de ces composants du tissu adipeux n’est pas bien établie, en grande partie à cause de la grande taille de la masse grasse corporelle et des taux de renouvellement apparemment très lents de tous les éléments. Cette combinaison a rendu l’étiquetage direct Les estimations indirectes de la lipolyse adipeuse des TG ont été faites à partir du taux de libération d’acides gras et de glycérol par le tissu adipeux dans la circulation sanguine , mais les techniques directes sont peu efficaces. les mesures du renouvellement ou du temps de résidence des TG tissulaires n’ont pas été effectuées. Le taux, et même l’occurrence, de prolifération adipocytaire mature sur chez l’homme adulte est également restée incertaine [,,]

Mesure de la réplication de l’ADN dans le tissu adipeux à l’aide d’eau lourde HO

La séquence de différenciation des adipocytes matures des cellules indifférenciées est montrée dans la figure A. La prolifération cellulaire est impliquée à plusieurs étapes du processus. La mesure la plus directe et la caractéristique de la division cellulaire est la réplication de l’ADN Ainsi, la production d’adipocytes matures peut Nous avons récemment développé une technique de marquage isotopique stable non radioactif / spectrométrie de masse pour la mesure de la synthèse de l’ADN. La technique implique le marquage métabolique de la fraction désoxyribose dR de dNTPs nouvellement formés avec du deutérium, administré soit sous forme de glucose marqué, par exemple de [,, H] -glucose ou d’eau lourde. HO ou DO figure B, et la mesure de spectrométrie de masse de la teneur en deutérium de dNTPs dans l’ADN L’incorporation des dNTP marqués au deutérium dans l’ADN répliquant révèle la fraction de l’ADN génomique nouvellement synthétisée pendant la période d’exposition au marqueur purine désoxyribonucléosides, comme la désoxyadénosine dA, présente l’avantage que la contribution de la voie de synthèse nucléosidique de novo est élevée et relativement constante, tandis que la contribution de la voie de récupération des nucléosides est plus faible et plus variable

Figure Vue largeDownload slideA, Un aperçu de la séquence de maturation des tissus adipeux adapté de Notez que les étapes du processus de différenciation du préadipocyte à l’adipocyte impliquent la prolifération cellulaire B, les voies d’incorporation des marqueurs dans l’ADN cellulaire. le glucose ou HO dans la réplication de l’ADN se produit par la voie DNNS de synthèse nucléotidique de novo et peut être mesuré par spectrométrie de masse H-dT, thymidine tritiée; BrdU, bromodésoxyuridine; dN, désoxyribonucléosides; DNPS, voies de synthèse de novo purine et pyrimidine; GP, glucose – phosphate; Glc, glucose; GNG, gluconéogenèse; NPD, nucléoside-diphosphate; PRPP, phosphoribose-pyrrophosphate; RP, ribose – phosphate; RR, ribonucléoside réductaseFigure View largeTélécharger la diapositiveA, Vue d’ensemble de la maturation des tissus adipeux adaptée de Notez que les étapes du processus de différenciation du préadipocyte à l’adipocyte impliquent la prolifération cellulaire B, les voies d’incorporation des marqueurs dans l’ADN cellulaire. du H-glucose ou du HO dans l’ADN répliquant se produit par la voie DNNS de synthèse nucléotidique de novo et peut être mesuré par spectrométrie de masse H-dT, thymidine tritiée; BrdU, bromodésoxyuridine; dN, désoxyribonucléosides; DNPS, voies de synthèse de novo purine et pyrimidine; GP, glucose – phosphate; Glc, glucose; GNG, gluconéogenèse; NPD, nucléoside-diphosphate; PRPP, phosphoribose-pyrrophosphate; RP, ribose – phosphate; RR, ribonucléoside réductaseCette approche du marquage métabolique des isotopes stables présente plusieurs avantages techniques par rapport aux méthodes traditionnelles de marquage de l’ADN, comme la H-thymidine ou la bromodésoxyuridine De plus, l’absence de mutagénicité ou de toxicité dans les marqueurs isotopes stables permet leur utilisation chez l’homme. Les lymphocytes T et B, les colonocytes, les cellules épithéliales mammaires et cutanées, les cellules musculaires lisses vasculaires, les hépatocytes, les monocytes, les granulocytes, les cellules tueuses naturelles, les cellules souches de la moelle osseuse, les cellules cancéreuses du sein, les cellules chroniques ont été étudiés. cellules leucémiques lymphocytaires, myocytes, et autres Les applications aux adipocytes F Antelo, KH Kim, R Hoh, et al, données non publiées; A Strawford, F Antelo, M Christiansen et MHK, des données non publiées et de l’ADN mitochondrial seront discutés ici voir ci-dessous

Mesure de la rotation des lipides dans le tissu adipeux en utilisant de l’eau lourde

L’ostéopénie, l’ostéoporose et l’ostéonécrose sont apparues comme des complications cliniquement significatives chez les patients infectés par le VIH à l’ère de la thérapie antirétrovirale. L’épidémiologie de ces troubles et leurs relations avec l’infection par le VIH restent largement indéterminées. Bien que les données disponibles sur la DMO soient inquiétantes, d’autres données longitudinales et, en particulier, des données sur l’incidence des fractures et leur relation avec les scores t seront d’une grande importance. Ces données aideront à déterminer qui a besoin d’une intervention à l’opposé de l’ostéopénie. ostéonécrose, l’ostéonécrose reste rare et donc plus difficile à étudier Des cohortes ou des bases de données plus importantes doivent être utilisées pour mieux définir l’épidémiologie de ce trouble potentiellement invalidant L’identification des patients à haut risque peut finalement conduire à des résultats cliniques améliorés grâce à un diagnostic précoce et interventio n

Application De Dynamiques Multiples De Tissu Adipeux Basé Sur Le Marquage HO: Rôle De La Déficience De Leptine Par rapport à Hyperphagie Chez Les Souris ob / ob

La souris ob / ob est un modèle monogénique d’obésité et de résistance à l’insuline causée par l’absence de sécrétion de leptine dans les tissus adipeux. La leptine, une protéine circulante dérivée des adiposes, a des effets sur la consommation alimentaire, la dépense énergétique et la répartition des nutriments. avec la masse du tissu adipeux du corps entier , une boucle de rétroaction négative ou un rôle «adipostat» pour la leptine a été suggéré Bien que la leptine ait suscité beaucoup d’intérêt en tant que médiateur de la masse adipeuse, les rôles indépendants de l’hyperphagie Le métabolisme du tissu adipeux des souris ob / ob n’a pas été clairement élucidé Nous avons étudié des groupes de souris femelles CBL / J: souris témoins normales nourries ad libitum, souris ob / ob nourries ad libitum ob / ob, ob / ob avec restriction alimentaire souris ob-r, et ob / ob souris traitées avec une perfusion sous-cutanée constante de leptine μg / jour ob-lepHO% a été administré comme eau potable pendant des jours, pour mesurer simultanément les processus de biosynthèse: triglycérides Synthèse lipogénèse totale, synthèse de l’acide palmitique DNL et prolifération cellulaire de réplication de l’ADN adipeux Par rapport à la souris, les taux absolus de synthèse de TG ~ vs g pour les jours et DNL vs g pour les jours étaient élevés jusqu’à-fois chez les souris ob / ob Un taux significativement plus élevé de moyenne de prolifération des cellules adipeuses, vs × cellules sur plusieurs jours et un taux de renouvellement adipeux TG ou une lipolyse nette totale du corps, par rapport au nombre de jours ont également été observés dans le groupe ob / ob. En revanche, l’administration de leptine a réduit toutes les mesures synthétiques DNL, ​​la synthèse de TG et l’adipogenèse. Dans le groupe ob-lep, la lipolyse a été réduite par une réduction de la lipolyse nette. plus élevé que dans tout autre groupe, alors que les taux d’insuline sérique sont restés élevés Nous concluons que la carence en leptine entraîne des élévations anormales de la DNL, ​​de la synthèse des TG et de la prolifération des cellules adipeuses et que Ces anomalies ne sont pas principalement dues à l’hyperphagie mais sont corrigées par l’administration de leptine précédant des changements majeurs dans la composition corporelle ou les niveaux d’insuline. Ces conclusions ont été rendues possibles par la disponibilité de techniques de mesure de la dynamique des tissus adipeux chez les animaux vivants

Figure Vue largeDownload slide Effets de l’administration de la leptine et du couple sur le métabolisme des lipides adipeux et la prolifération cellulaire chez les souris ob / ob A, triglycérides TG synthèse B, lipogénèse palmitate de novo absolue DNL C prolifération cellulaire absolue Quatre groupes sont comparés, comme décrit dans le texte contrôle, ob / ob, ob / ob-limité, et ob / ob-leptine Les valeurs ne partageant pas un exposant sont significativement différentes P & lt; Figure Vue largeDownload slide Effets de l’administration de la leptine et du couple sur le métabolisme des lipides adipeux et la prolifération cellulaire chez les souris ob / ob A, triglycérides TG synthèse B, lipogénèse palmitate de novo absolue DNL C prolifération cellulaire absolue Quatre groupes sont comparés, comme décrit dans le texte contrôle, ob / ob, ob / ob-limité, et ob / ob-leptine Les valeurs ne partageant pas un exposant sont significativement différentes P & lt;

Résultats préliminaires chez des sujets humains en bonne santé et des patients atteints du VIH / SIDA qui avaient et qui n’avaient pas eu

Des études pilotes ont été réalisées chez l’homme qui ont mesuré le renouvellement des composants du tissu adipeux A Strawford, F Antelo, R Hoh et MKH, observations non publiées; F Antelo, K-H Kim, R Hoh, et al, données non publiées; A Strawford, F Antelo, M Christiansen et MHK, données non publiées Pour ces études, HO a été administré à des sujets sous forme de dose quotidienne ml / jour pendant – semaines, dans des conditions de vie libre, ambulatoires Après et – des semaines de consommation quotidienne d’HO Les aspirats d’aiguille de tissu adipeux percutané ont été obtenus sous anesthésie locale à la lidocaïne avec une aiguille -gauge provenant des dépôts adipeux sous-cutanés des régions fessière, cuisse et flanc Les lipides ont été extraits, isolés et dérivatisés pour analyse par chromatographie en phase gazeuse / spectrométrie de masse. On a également préparé une fraction de fraction TG-glycérol à charge [m / z] du dérivé de glycérol-triacétate et de TG-palmitate m / z- de palmitate-méthylester. On a également préparé une fraction enrichie en adipocytes matures, appauvrie en stroma-vasculaire, de tissu adipeux. digestion enzymatique de la matrice de collagène du tissu adipeux à des cellules libres, suivie d’une centrifugation différentielle, pour isoler la fraction adipocytaire mature moins dense F Antelo, KH Kim, R Hoh, et al, l’ADN des données non publiées était préparé à partir des fractions cellulaires isolées et hydrolyse enzymatiquement en désoxyribonucléosides libres, et la dA libre a été isolée La fraction dR de dA a été dérivée en pentose-tetraacetate et analysée par GC / MS m / z -, ionisation chimique Body Le taux de renouvellement normal des TG des tissus adipeux était assez lent, ce qui est cohérent avec les estimations indirectes antérieures Le remplacement fractionné des TG après des semaines d’ingestion d’HO a été très lent. % -% dans les dépôts chez les sujets humains sains stables en poids La demi-vie des TG adipeux a été calculée dans l’intervalle de – jours, bien qu’il y ait une variabilité interindividuelle considérable. Synthèse / décomposition nette, lipolyse nette, dans des conditions stables en poids was – g / day ~ – mg / kg / min Ce sont les premières mesures directes à long terme du renouvellement de l’adipose-TG chez l’homme et elles sont congruentes avec les estimations indirectes précédentes Il n’y avait pas d’effets cinétiques de l’infection par le VIH Remarquablement, les patients atteints d’AL qui avaient une masse adipeuse sous-cutanée fortement réduite ne présentaient aucune différence dans le taux de remplacement fractionné ou la demi-vie apparente de la figure adipeuse TG. Ainsi, les réserves de TG présentes dans le tissu adipeux sous-cutané de tous les les dépôts de graisse échantillonnés ont montré un temps de résidence très long & gt; mois, plutôt qu’un état hyperlipolytique et à haut taux de renouvellement qui aurait pu être attendu si les LA étaient causées par des actions cataboliques directes sur les adipocytes matures ou par la stimulation des hormones cataboliques agissant sur les adipocytes matures. Ces résultats démontrent directement que le taux absolu de synthèse TG et la dégradation a été considérablement réduite chez les patients infectés par le VIH / LA. Le dépôt altéré de nouvelles TG représente donc l’explication cinétique de l’épuisement de la graisse sous-cutanée chez les patients atteints de TAR associée au TAR.

Trois dépôts adipeux sous-cutanés ont été prélevés dans chaque groupe: gluté G, flanc F et cuisses T Aucune différence statistiquement significative du taux de remplacement fractionnaire k du tissu adipeux TG n’était présente entre les groupes ou les dépôtsFigure VasteTélécharger glissementTournage du triglycéride adipeux TG dans différents groupes de Résultats chez des sujets témoins sains, des sujets infectés par le VIH sans lipoatrophie LA et des sujets infectés par le VIH avec LA sont indiqués après les semaines gauche et droite de l’apport quotidien en HO Trois dépôts adipeux sous-cutanés ont été prélevés dans chaque groupe: glutéaux G , flanc F, et la cuisse T Aucune différence statistiquement significative dans le taux de remplacement fractionnaire k du tissu adipeux TG étaient présents entre les groupes ou les dépôts Dans un sous-ensemble de sujets, des échantillons de tissu adipeux répétitifs ont été prélevés – mois après l’arrêt des ont révélé une longue durée de vie de la TG adipeuse stockée chez des patients atteints de LA similaire à celle de témoins sains, Conformément aux estimations d’incorporation de la demi-vie du tissu adipeux dans le tissu adipeux DNL DNL a contribué% du palmitate adipeux TG après des semaines d’ingestion d’HO chez des sujets humains sains. Après correction pour le remplacement tissulaire de TG, la fraction de TG nouvellement la voie DNL était approximativement de% Ce sont les premières mesures directes de DNL de tissu adipeux à long terme chez l’homme et sont en gros cohérentes avec des mesures antérieures à court terme ou des estimations indirectes. Comme la synthèse absolue de TG était significativement plus faible dans le groupe VIH / AL que dans les autres groupes voir ci-dessus, le flux absolu à travers le DNL dans les TG adipeuses stockées n’a pas été significativement différent. était proportionnellement plus faible chez les patients VIH / LA Il n’y avait pas de carence spécifique dans cette voie d’accumulation de lipides, cependantAdipo La prolifération cellulaire dans le tissu adipeux sous-cutané n’a pu être mesurée que chez les témoins sains et les groupes HIV / no LA, car les rendements tissulaires des cellules étaient trop faibles pour la mesure par GC / MS de l’enrichissement de l’ADN dans le VIH / LA groupe Chez les sujets sains, le taux de renouvellement cellulaire était demi-vie lente, – jours dans la fraction cellulaire enrichie en adipocytes matures La fraction vasculaire stromale des cellules présentait un taux de renouvellement plus rapide A Strawford, F Antelo, M Christiansen, et MHK, non publié Les patients infectés par le VIH mais sans LA ne présentaient pas de différences significatives dans les taux de renouvellement fractionnel des cellules dans la fraction appauvrie en adipocytes matures / stromal-vasculaire-appauvri ou la demi-vie stromal-vasculaire également dans la gamme de – monthGene expression dans tissu adipeux Nous avons également mesuré l’expression de gènes liés à l’état de différenciation des tissus adipeux. F Antelo, KH Kim, R Hoh, et al, données non publiées La RT-PCR a été utilisée sur adi Les ARNm tissulaires du récepteur activateur de la prolifération des peroxysomes γ PPARγ, la leptine et la protéine adipocytaire P ont été mesurés en tant que marqueurs d’adipocytes matures différenciés De plus, l’expression tissulaire KH Kim, HS Sul, et MKH, observations non publiées Les patients atteints de VIH / LA ont montré une absence presque complète de préf-expression Dans le tissu adipeux, qui indique une réduction ou une absence de préadipocytes. En revanche, l’expression tissulaire de PPARγ, leptine et AP a tendance à être plus élevée lorsque normalisée pour l’expression de la glycéraldéhyde-phosphate déshydrogénase de tissus entiers. le tissu Ainsi, les adipocytes présents expriment normalement des marqueurs de différenciation, mais il semble y avoir une déficience indifférenciée Sur la base de ces résultats préliminaires, nous concluons que le lipide présent dans le tissu adipeux sous-cutané de patients atteints du VIH / LA présente une cinétique normale et une durée de vie normale et que les adipocytes matures sont présents dans le tissu adipeux sous-cutané. présent dans le tissu présente l’expression normale des marqueurs de différenciation Cependant, le tissu est caractérisé par une déplétion des préadipocytes et par un taux de synthèse absolu fortement réduit de TG, malgré la présence d’un milieu hormonal prolipogénique ie hyperinsulinémie et faible taux de leptine sérique. a été discuté ci-dessus, la leptine supprime la synthèse lipidique totale, DNL, ​​et la prolifération cellulaire dans le tissu adipeux, indépendamment de l’apport alimentaire, et plusieurs études ont documenté de faibles concentrations sériques de leptine chez les patients VIH / LA ou DNL chez les patients atteints du VIH / LA implique donc une insensibilité de l’organe terminal, c’est-à-dire une incapacité à répondre à la signal faible de leptine

CHIFFRE D’AFFAIRES DE L’ADNmt ET DU SYNDROME DE TOXICITÉ MITOCHONDRIALE

Une hypothèse de base de l’étiologie de nombreux effets indésirables liés au TAR est le modèle de toxicité mitochondriale Cette hypothèse postule que les INTI inhibent la réplication de l’ADNmt de la mitochondrie spécifique à l’évolution de l’ADNmt γ est nécessaire à la biogenèse des nouvelles mitochondries, qui peut tourner indépendamment des cellules [,,] En conséquence de l’inhibition de l’ADN polymérase γ, les tissus clés, tels que le foie, les muscles, les tissus adipeux et nerveux, peuvent lentement s’épuiser des mitochondries fonctionnelles, ce qui entraîne un dysfonctionnement tissulaire [, Il a été difficile de tester directement cette hypothèse, car aucune méthode de mesure de la réplication mtDNA n’a été directement disponible. La technique de mesure de la synthèse de l’ADN génomique dans les cellules HO peut être appliquée avec la même validité que l’ADNmt A Strawford , F Antelo, M Christiansen et MHK, données non publiées Nous avons réalisé des études pour développer la méthode de synthèse de l’ADN mitochondrial dans les tissus des rongeurs et chez les humains. Les mitochondries ont été isolées à partir de tissus squelettiques et de tissus cardiaques par centrifugation différentielle , et les échantillons tissulaires ont été récoltés après différentes périodes d’étiquetage. L’incorporation de deutérium dans l’ADN mitochondrial a augmenté au cours du temps. La demi-vie a été calculée comme étant – jours pour l’ADNmt cardiaque et squelettique, respectivement. Des différences significatives étaient apparentes pour le squelette. Comparativement au taux de renouvellement réel des mitochondries, une partie de la synthèse de l’ADN mitochondrial pourrait refléter la croissance somatique. La croissance somatique, ou division cellulaire, nécessite la biogenèse de nouvelles mitochondries, y compris de nouveaux ADNmt, pour maintenir une En conséquence, la réplication de l’ADNmt a été comparée à celle de l’ADNn dans les tissus musculaires des rats en croissance. Les résultats ont montré que la synthèse de l’ADNn ne pouvait expliquer qu’une partie de la réplication de l’ADNmt. Des rats femelles adultes stables ont également été étudiés: leur poids corporel a augmenté de seulement% pendant la période de marquage HO chez ces animaux, mais une replication de l’ADNmt du muscle cardiaque a été observée après l’arrêt de l’administration de HO, les courbes d’élimination de l’ADN mitochondrial a donné des taux de rotation lente similaire

La synthèse somatique différenciée de la migration mitochondriale chez des rats recevant HO dans l’eau potable est comparée à celle de la synthèse d’ADNmt chez des rats mâles normaux. La synthèse fractionnaire excédentaire f de l’ADNmt comparée à l’ADNn signifie le remplacement de l’ADN mitochondrial indépendant de la cellule. La synthèse somatique différenciée de la migration mitochondriale chez des rats ayant reçu HO dans l’eau potable est comparée à celle de la synthèse d’ADNmt dans le muscle de rats mâles normaux. La synthèse fractionnaire excédentaire de l’ADN mitochondrial par rapport à l’ADNn signifie le remplacement de l’ADN mitochondrial indépendant de la prolifération cellulaire et de la croissance somatique

Tableau View largeTélécharger la diapositive Synthèse fractionnelle f constantes du taux de remplacement de l’ADN mitochondrial du muscle cardiaque et de la patte arrière chez des rats femelles stables en poids n = animaux par point temporelTable Voir grandDownload slideFormation fractionnelle f constantes du taux de remplacement de l’ADN mitochondrial du muscle squelettique On a ajouté un agent NRTI, de l’AZT-azido-désoxythymidine, à de l’eau en mg / mL et on l’a administré ad libitum à des rats femelles Sprague-Dawley pendant des semaines. Ni le poids corporel ni la ration alimentaire n’ont été mesurés. affecté par l’ingestion d’AZT Les témoins non traités et les rats traités à l’AZT ont été marqués avec% HO pendant des semaines. L’apport d’AZT a produit un P & lt significatif; diminution de la synthèse fractionnelle de l’ADNmt du muscle cardiaque et du membre postérieur par rapport aux groupes témoins de ±% à ±% et de ±% à ±%, respectivement après les semaines Figure A La teneur en cytochrome c oxydase du membre postérieur diminue également de contrôles après des semaines de traitement à l’AZT P & lt; Le taux de biogenèse mitochondriale absolue a été significativement réduit par semaine de traitement à l’AZT P & lt; figure B Nous avons conclu que la synthèse de l’ADN mitochondrial est mesurable par cette technique de marquage HO et permet de tester ou de cribler rapidement des agents ART potentiellement mitochondriaux dans des modèles animaux M Collins et MKH, données non publiées

Figure Vue largeTéléchargement de l’AZT sur la synthèse de l’ADNmt dans le muscle des rats normaux A, Synthèse fractionnée de l’ADN mitochondrial pendant des semaines de traitement par l’AZT Des différences significatives étaient présentes entre les valeurs de base et de semaine dans le squelette gauche et cardiaque muscle P & lt; B, Les taux absolus de biogenèse mitochondriale pendant des semaines de traitement à l’AZT sont indiqués Des différences significatives par rapport à la ligne de base étaient présentes par semaine de traitement à l’AZT P & lt; Figure Vue largeTéléchargement de l’AZT sur la synthèse de l’ADNmt dans le muscle des rats normaux A, Synthèse fractionnée de l’ADN mitochondrial pendant des semaines de traitement par l’AZT Des différences significatives étaient présentes entre les valeurs de base et de semaine dans le squelette gauche et cardiaque muscle P & lt; B, Les taux absolus de biogenèse mitochondriale pendant des semaines de traitement à l’AZT sont indiqués Des différences significatives par rapport à la ligne de base étaient présentes par semaine de traitement à l’AZT P & lt; Études humaines sur le renouvellement de l’ADNmt Nous avons réalisé des études pilotes sur le renouvellement de l’ADNmt dans les plaquettes sanguines de l’homme Sujets recevant HO par voie orale pendant des semaines mL / jour et du sang prélevé à des points de temps mL / tirage Les plaquettes manquent de noyaux et sont riches en mitochondrie; ils représentent donc un tissu idéal et facilement accessible pour tester les effets des agents ou gènes suspectés de modifier le renouvellement de l’ADNmt. Les mitochondries ont été isolées des plaquettes par centrifugation, et l’ADN a été isolé. L’absence de contamination par l’ADN natif a été confirmée par PCR. Les résultats des études préliminaires ont suggéré un taux d’incorporation réduit de deutérium dans les plaquettes d’ADN mitochondrial. Les résultats des études préliminaires ont suggéré un taux d’incorporation réduit de deutérium dans les plaquettes d’ADN mitochondrial (mtADN). M Collins et MKH, observations non publiées Des mesures analogues du renouvellement de l’ADNm dans les plaquettes ou d’autres tissus humains, par exemple les lymphocytes et les tissus musculaires, adipeux et hépatiques, sont maintenant possibles, avec l’approche de marquage HO décrite ici. le test direct des effets des agents NRTI sur les biogenesi mitochondriaux s

Résumé et conclusions

Ces résultats utilisant la technique de marquage HO représentent une preuve de principe que le taux de renouvellement des composants du tissu adipeux et de l’ADN mitochondrial dans les cellules musculaires ou sanguines peut être mesuré in vivo. Les techniques sont applicables chez les sujets humains ainsi que chez les modèles animaux expérimentaux. a souligné que la mesure directe des taux de synthèse et de dégradation de toute composante moléculaire d’un organisme qui présente une rotation très lente est difficile, a priori. Ce fait méthodologique de la vie concernant la cinétique des molécules à longue durée de vie limite la mesure du collagène osseux. Malheureusement, tous les éléments moléculaires clés supposés être impliqués dans les toxicités ART ont exactement cette caractéristique cinétique, y compris la TG adipeuse, les adipocytes et l’ADN mitochondrial dans des cellules telles que le muscle. être le cas que les toxicités qui évoluent le plus lentement résultent d’une altération de la dynamique de Composantes moléculaires ou cellulaires ived Ces toxicités, par nature, échapperont aux études de toxicité aiguë actuellement utilisées pour tester et approuver les médicaments. Les processus biosynthétiques qui prennent des mois ou des années à se manifester en pathologie clinique sont donc des cibles privilégiées des toxicités ART. d’autres classes d’agents qui doivent être pris pendant des années dans le traitement des maladies chroniques peuvent également suivre cette règle. Il est donc important et très encourageant que des techniques de mesure cinétique directe puissent être développées pour mesurer les changements dans la synthèse ou la dégradation les composants chez les humains et les animaux de laboratoire et ont montré une sensibilité et une précision excellentes La demi-vie de la TG et des cellules adipeuses chez l’homme est de – mois; Même en présence d’une rotation aussi lente, les différences entre les tissus ou les paramètres physiologiques étaient mesurables, en raison des caractéristiques uniques de l’étiquetage HO, administré facilement pendant de très longues périodes sans toxicité, simplement en donnant comme l’analyse de l’eau potable et de la MS, extrêmement sensible et reproductible Le fait que les paramètres puissent être mesurés par les mêmes méthodes chez un animal ou un sujet humain représente un avantage pratique important de cette approche. Bien que les résultats présentés ici soient préliminaires, il est clair que Des études systématiques peuvent facilement être réalisées à l’aide de ces outils. Plusieurs applications peuvent être envisagées. La dynamique adipeuse pourrait être utile lors d’une exposition précoce au TAR lorsque les composants du tissu adipeux, y compris les cellules, sont encore abondants et l’inhibition précoce des dépôts lipidiques peut être apparente, pour identifier les patients sur le chemin des essais LA d’un traitement antirétroviral modifié ou d’un Les essais de toxicité mitochondriale ou adipocytaire, dans des études précliniques sur des animaux ou dans des essais de Phase I-III de la Food and Drug Administration des États-Unis, constituent une autre utilisation potentielle des thiazolidinediones. Enfin, la prise en charge individuelle des patients peut s’avérer possible un jour si des tests cinétiques sont utilisés comme mesure des résultats coup de soleil. Comme dans tous les troubles cliniques, la présence ou l’absence de biomarqueurs fiables Ce principe est illustré par la prévention des maladies cardiovasculaires, où les concentrations sériques de lipides et la pression artérielle sont reconnues comme des mesures de résultats traitables à part entière, en raison de leur relation avec les résultats cliniques difficiles, au point que la classe la plus vendue de médicaments dans le monde les statines traite un biomarqueur cholestérol, pas une condition symptomatique Des déclarations similaires peuvent être faites en ce qui concerne le diabète, par exemple, les concentrations d’hémoglobine AC ou de glucose dans le sang, la charge virale plasmatique et d’autres conditions. D’autre part, le traitement et la prévention du cancer ont été reconnus Transformer les toxicités VIH / ART, telles que LA et la dysfonction mitochondriale, de cette dernière classe pas de biomarqueurs fiables pour guider la gestion de l’ancienne classe de biomarqueurs efficaces disponibles pour guider la gestion pourrait avoir implications profondes pour ces conditions cliniques importantes Les résultats résumés ici suggèrent que l’incorporation du marqueur HO dans les composants du tissu adipeux et dans l’ADN mitochondrial peut représenter des biomarqueurs cinétiques utiles pour les toxicités VIH / ART.

Remerciements

Je remercie les nombreux collègues et étudiants qui ont participé au travail. En particulier, Dr Alison Strawford, Rebecca Hoh, Fernando Antelo, Michelle Collins, Dr Mark Christiansen, Dr Richard Neese, Denise Cesar et Meghan Lane ont tous apporté d’importantes contributions sans lesquelles ce travail n’aurait pas pu être fait Les infirmières du Centre général de recherche clinique de l’Hôpital général de San Francisco ont également contribué à ces études, ce dont je suis reconnaissant. Il est à noter que certaines des techniques décrites ici ont été brevetées par l’Université de Californie à Berkeley et MKH et autorisé pour un usage commercial potentiel à KineMed, Inc, Emeryville, CA